【摘要】：深海環(huán)境蘊(yùn)含著數(shù)量巨大、種類豐富的微生物資源。微生物是深海生態(tài)系統(tǒng)的最主要成員,深海微生物之間存在著復(fù)雜的相互作用。但目前對深海微生物之間的相互作用類型及機(jī)制還了解很少。深海有機(jī)質(zhì)大多是高分子量的顆粒有機(jī)質(zhì)(particulate organic matter,POM),因此,深海微生物通過分泌胞外酶對胞外大分子的有機(jī)物進(jìn)行降解并利用,是一種生存和適應(yīng)環(huán)境的方式。來自細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖和來自動(dòng)物的膠原蛋白是深海顆粒POM的重要成分,它們在深海中被微生物通過分泌蛋白酶降解和利用,進(jìn)入深海碳氮循環(huán)。但目前我們對參與深海肽聚糖和膠原蛋白等有機(jī)質(zhì)降解的微生物及其酶類的種類及降解機(jī)制還了解有限。假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)是一類廣泛分布于海洋環(huán)境中的異養(yǎng)細(xì)菌。Pseudoalteromonas sp.CF6-2是一株分離自南中國海深海沉積物的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌。前期研究表明,該菌分泌的適冷蛋白酶Pseudoalterin是一個(gè)M23家族金屬蛋白酶,能夠降解彈性蛋白和革蘭氏陽性菌肽聚糖。在此基礎(chǔ)上,本論文首先建立了菌株CF6-2的遺傳操作體系和蛋白酶Pseudoalterin的適冷表達(dá)體系,然后對蛋白酶Pseudoalterin的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制、成熟機(jī)制、分泌機(jī)制和催化機(jī)制進(jìn)行了研究,揭示了菌株CF6-2利用Pseudoalterin捕食海洋革蘭氏陽性細(xì)菌的生態(tài)學(xué)現(xiàn)象,建立了利用CF6-2發(fā)酵生產(chǎn)Pseudoalterin的小試和中試工藝。另外,本論文還研究了來自膠州灣沉積物的細(xì)菌Photobacterium sp.A5-7分泌的一個(gè)新的S8家族絲氨酸蛋白酶P57的酶學(xué)性質(zhì)及其PA結(jié)構(gòu)域的功能。論文取得了如下研究結(jié)果:1.在基因組層面上分析海洋細(xì)菌胞外蛋白酶多樣性為了在基因組層面分析海洋中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的胞外蛋白酶的種類多樣性,我們對兩株海洋產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌一深海沉積物細(xì)菌P.sp.CF6-2和北極表層海水細(xì)菌Flavobacterium arcticum SM1 502T的全基因組進(jìn)行了測序,在基因組層面上揭示了這兩株菌的胞外蛋白酶及其它胞外酶種類多樣性。菌株CF6-2的基因組編碼50種具有信號肽的肽酶,包括28個(gè)絲氨酸肽酶和22個(gè)金屬肽酶。這些酶分布于9個(gè)絲氨酸肽酶家族和15個(gè)金屬肽酶家族。菌株SM1502T的基因組編碼29個(gè)具有信號肽的肽酶,包括14個(gè)絲氨酸肽酶、11個(gè)金屬肽酶和4個(gè)半胱氨酸肽酶。這些酶分布于7個(gè)絲氨酸肽酶家族、5個(gè)金屬肽酶家族和4個(gè)半胱氨酸肽酶家族。這些結(jié)果表明,這兩株菌都含有大量的胞外蛋白酶基因,可能在海洋沉積物有機(jī)氮降解和循環(huán)中發(fā)揮重要作用。2.深海細(xì)菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表達(dá)的誘導(dǎo)機(jī)制海洋細(xì)菌胞外蛋白酶大多是受胞外物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)的,但誘導(dǎo)細(xì)菌胞外蛋白酶產(chǎn)生的確切信號分子至今尚未被鑒定出。本文對誘導(dǎo)細(xì)菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表達(dá)的信號分子進(jìn)行了鑒定。由于蛋白酶Pseudoalterin能夠高效地降解革蘭氏陽性細(xì)菌肽聚糖的肽鏈部分,因此,我們的科學(xué)假設(shè)是:肽聚糖中的某些組分可能對Pseudoalterin具有誘導(dǎo)作用。為此,我們嘗試從肽聚糖肽鏈組分中鑒定Pseudoalterin表達(dá)的誘導(dǎo)信號分子。首先檢測了海洋典型革蘭氏陽性菌Staphylococcus warneri MCCC0423的肽聚糖在轉(zhuǎn)錄水平上對Pseudoalterin的誘導(dǎo)作用。然后根據(jù)MCCC0423肽聚糖肽鏈的序列合成19種小肽,檢測這19種寡肽及其中所含單個(gè)氨基酸對Pseudoalterin轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含Gly寡肽及Gly對Pseudoalterin有誘導(dǎo)作用,為CF6-2表達(dá)Pseudoalterin的誘導(dǎo)信號分子。Gly的有效誘導(dǎo)濃度在0.25 mM-20 mM。這是首次揭示了微生物胞外蛋白酶的確切誘導(dǎo)信號分子并確定了其有效誘導(dǎo)濃度。另外,我們還確定了 Pseudoalterin的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),為進(jìn)一步闡明細(xì)菌CF6-2對Pseudoalterin合成的胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.深海細(xì)菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin的成熟和分泌機(jī)制前期研究表明,M23家族蛋白酶Pseudoalterin沒有自成熟的能力,需要其他蛋白幫助其切割前導(dǎo)肽。但哪些蛋白輔助Pseudoalterin成熟還不清楚。為了鑒定Pseudoalterin成熟的輔助蛋白和闡明其成熟機(jī)制,我們首先建立了菌株CF6-2的遺傳操作體系,然后通過分析其他M23家族蛋白酶的成熟過程找出可能在Pseudoalterin成熟過程中起作用的輔助蛋白。利用菌株CF6-2的遺傳操作體系對這些輔助蛋白進(jìn)行基因敲除,然后分析突變對胞外Pseudoalterin的影響,從而確定了三個(gè)對Pseudoalterin成熟有輔助作用的蛋白酶,Lysyl、Serine1和Serine5。信號肽預(yù)測結(jié)果表明這三個(gè)蛋白酶可能位于周質(zhì)空間。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),全細(xì)胞上清中存在Pseudoalterin的成熟形式,因此推測Pseudoalterin前導(dǎo)肽的切割發(fā)生在周質(zhì)空間。通過分析菌株CF6-2的基因組,發(fā)現(xiàn)其具有完整的II型分泌系統(tǒng)(Type II secretion system,T2SS)。我們推測CF6-2可能通過T2SS分泌Pseudoalterin。我們將T2SS中的關(guān)鍵基因gspE缺失突變后,CF6-2的發(fā)酵液幾乎檢測不到Pseudoalterin,回補(bǔ)缺失基因后,Pseudoalterin的分泌得到了恢復(fù)。因此可以確定Pseudoalterin是通過T2SS分泌到胞外的。4.深海細(xì)菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin結(jié)合和催化降解肽聚糖的機(jī)制前期研究表明,菌株CF6-2分泌的蛋白酶Pseudoalterin有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,含Zn離子的催化結(jié)構(gòu)域能水解肽聚糖的肽鏈,另一個(gè)與催化結(jié)構(gòu)域呈T字形緊密排列的C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合肽聚糖糖鏈。Pseudoalterin能夠降解革蘭氏陽性細(xì)菌肽聚糖,但其結(jié)合和催化肽聚糖降解的分子機(jī)制尚未揭示。為了研究Pseudoalterin結(jié)合和催化肽聚糖降解的分子機(jī)制,我們通過分子對接的方法,將肽聚糖肽尾AeKaA和肽橋AGGGGG與Pseudoalterin催化腔進(jìn)行分子共模擬,并結(jié)合同源序列分析,預(yù)測了 Pseudoalterin參與催化肽聚糖降解的關(guān)鍵氨基酸殘基。然后,我們構(gòu)建了 Pseudoalterin的在海洋適冷細(xì)菌中的適冷表達(dá)體系,并利用該體系對關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行了突變表達(dá)和純化,并構(gòu)建及純化了C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失突變體。通過測定Pseudoalterin突變體對肽聚糖的降解活性和吸附能力的變化,闡明了 Pseudoalterin結(jié)合和催化降解肽聚糖的機(jī)制。這是首次揭示了一個(gè)深海細(xì)菌蛋白酶對細(xì)菌肽聚糖降解的分子機(jī)制。5.深海細(xì)菌CF6-2及其胞外蛋白酶Pseudoalterin的生態(tài)功能細(xì)菌分泌的M23家族蛋白酶可以裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖,從而可為細(xì)菌獲取食物并進(jìn)行防御和競爭提供優(yōu)勢。為了闡明菌株CF6-2與海洋革蘭氏陽性細(xì)菌之間的相互作用,我們通過平板實(shí)驗(yàn)對菌株CF6-2與海洋革蘭氏陽性細(xì)菌進(jìn)行了共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)菌株CF6-2能夠裂解多種海洋革蘭氏陽性細(xì)菌并利用裂解細(xì)菌產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長,表明菌株CF6-2可能具有捕食海洋革蘭氏陽性細(xì)菌的能力。然后,以 Staphylococcus warneri MCCC1A00423為對象,研究了P.sp.CF6-2通過分泌蛋白酶Pseudoalterin對革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖進(jìn)行降解,導(dǎo)致細(xì)菌裂解和死亡,從而從中獲取營養(yǎng)進(jìn)行生長和繁殖的機(jī)制。根據(jù)研究結(jié)果提出了海洋革蘭氏陰性菌CF6-2捕食海洋革蘭氏陽性菌的模型。通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)多株來源于海洋的細(xì)菌(大多數(shù)為革蘭氏陰性菌)含有蛋白酶Pseudoalterin的同源序列,因此推測我們揭示的革蘭氏陰性菌通過胞外蛋白酶捕食革蘭氏陽性細(xì)菌的現(xiàn)象在海洋生態(tài)環(huán)境中可能具有普遍性,這是一種新的存在于海洋細(xì)菌之間的相互作用關(guān)系。6.深海細(xì)菌CF6-2產(chǎn)胞外蛋白酶Pseudoalterin的小試和中試發(fā)酵M23家族蛋白酶能夠降解肽聚糖和彈性蛋白,因此在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)上具有一定的應(yīng)用潛能。為了降低發(fā)酵成本并同時(shí)提高Pseudoalterin的產(chǎn)量,在前期優(yōu)化的基礎(chǔ)上,我們通過單因子實(shí)驗(yàn)對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。以0.5%的蔗糖為碳源,將牛心管粉的用量從1.2%減少到0.6%,將Pseudoalterin的產(chǎn)量提高了 161%(161.2± 3.1 U/mL)。在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上,對小試5 L發(fā)酵罐和中試50 L發(fā)酵罐發(fā)酵CF6-2生產(chǎn)Pseudoalterin的通氣量和攪拌速度進(jìn)行了優(yōu)化,建立了深海細(xì)菌CF6-2產(chǎn)胞外蛋白酶Pseudoalterin的小試和中試發(fā)酵工藝。小試和中試中Pseudoalterin的產(chǎn)量分別達(dá)到155.6±10.5 U/mL和103.5±8.6 U/mL。研究結(jié)果為Pseudoalterin的工業(yè)化生產(chǎn)和其在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)上的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。7.新型S8家族絲氨酸蛋白酶P57的酶學(xué)性質(zhì)和PA結(jié)構(gòu)域的功能在系統(tǒng)開展海洋細(xì)菌蛋白酶Pseudoalterin研究的基礎(chǔ)上,本論文對海洋細(xì)菌分泌的另外新型S8家族絲氨酸蛋白酶P57的酶學(xué)性質(zhì)和PA結(jié)構(gòu)域的功能進(jìn)行了研究。Photobacterium sp.A5-7是一株分離自膠州灣沉積物的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌。本文對Photobacterium sp.A5-7分泌的一個(gè)蛋白酶P57進(jìn)行了純化和表征。P57是一個(gè)新的S8家族枯草桿菌素類蛋白酶,能水解酪蛋白、明膠和膠原蛋白。成熟的P57具有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PA結(jié)構(gòu)域。對異源表達(dá)融合蛋白PA-EGFP的分析表明,PA結(jié)構(gòu)域?qū)δz原具有吸附能力。通過Fe3+抑制P57的酶活,檢測到了 P57與膠原的結(jié)合。通過定點(diǎn)突變分析,發(fā)現(xiàn)Phe349和Tyr432是P57結(jié)合膠原的關(guān)鍵氨基酸殘基。這些結(jié)果表明P57能通過PA結(jié)構(gòu)域結(jié)合膠原底物。該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次提供了枯草桿菌素類蛋白酶的PA結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不溶性底物的直接證據(jù),對更好地了解來自海洋沉積物中細(xì)菌胞外蛋白酶和枯草桿菌素蛋白酶PA結(jié)構(gòu)域的功能具有重要意義。綜上所述,本論文對深海細(xì)菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin在海洋肽聚糖降解和海洋生物競爭的生態(tài)學(xué)功能方面進(jìn)行了較為深入的研究,同時(shí)研究了Pseudoalterin的誘導(dǎo)、成熟、分泌和催化機(jī)制,這些研究有助于我們更好地了解細(xì)菌及其胞外蛋白酶在深海物質(zhì)循環(huán)和微生物相互關(guān)系中的作用。能夠降解肽聚糖的蛋白酶Pseudoalterin在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)上具有很好的應(yīng)用價(jià)值,因此對本文建立的其進(jìn)行的生產(chǎn)Pseudoalterin的中試發(fā)酵工藝為其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。另一方面,在研究胞外蛋白酶Pseudoalterin的同時(shí)此外,我們本文建立了菌株CF6-2的遺傳操作體系和適冷蛋白酶的適冷表達(dá)體系,這對研究深海細(xì)菌其它適冷菌和適冷蛋白具有重要意義。本文對蛋白酶P57的酶學(xué)性質(zhì)及PA結(jié)構(gòu)域的研究,對更好地了解來自海洋沉積物中細(xì)菌胞外蛋白酶和枯草桿菌素蛋白酶PA結(jié)構(gòu)域的功能以及闡明海洋沉積物中顆粒有機(jī)氮降解具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936
【圖文】：

尾之間由肽橋連接，肽橋多為短肽，如在＆0ｐ／＾／ｏｃｏｃｃｗｓ邋ａｗｒｅｗｓ中，肽橋?yàn)楦拾卞义纤嵛咫摹Ｅc其他蛋白的肽鏈不同，肽聚糖中的肽尾含有Ｄ型氨基酸：Ｄ－丙氨酸、逡逑Ｄ－谷氨酸和Ｄ－谷氨酰胺（圖１－１），因此難以被一般的蛋白酶降解。逡逑Ｄｉｒｅｃｔ邋ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋ邐Ｉｎｔｅｒｐｅｐｔｉｄｅ邐ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋ逡逑Ａ邋ｇｒａｍ－ｎｅｇａｉｖｅ／ｐｏｓｉｔｉｖｅ邐Ｂ邋ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ逡逑（ａｉｃＮｉ％｝邋ｆ邋灥

本文編號：2798579