發(fā)布時間：2020-08-21 09:12

【摘要】：晝夜節(jié)律是最常見、研究最深入的一類生物節(jié)律。模式生物黑腹果蠅Drosophila melanogaster中已鑒定出多個生物鐘基因,發(fā)現(xiàn)這些基因及其表達產(chǎn)物共同組成的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路構(gòu)成其生物鐘核心分子機制,關(guān)于黑腹果蠅以外昆蟲的生物鐘基因研究較少。優(yōu)雅蟈螽是1種人們喜聞樂見的鳴蟲,其鳴叫具有明顯的晝夜節(jié)律性,每日早晚各有1個鳴叫高峰。對優(yōu)雅蟈螽的鳴叫節(jié)律調(diào)控進行深入研究有助于理解發(fā)聲昆蟲的鳴叫機理,具有較為重要的科學(xué)意義。本研究在前期測得優(yōu)雅蟈螽成體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,對period(per)、timeless(tim)、cryptochrome(cry)和clockwork orange(cwo)4個生物鐘基因進行3個方面研究。首先,利用RT-PCR、RACE等技術(shù)獲得上述4個生物鐘基因的cDNA全長,并對其序列進行生物信息學(xué)分析。然后,通過實時熒光定量PCR研究4個生物鐘基因在優(yōu)雅蟈螽不同發(fā)育階段頭部、成蟲不同組織中的相對表達量。最后,在3種光周期(自然光周期、L:D=12:12光周期、D:L=12:12黑白顛倒光周期)馴化1周后,分別于0:00、6:00、12:00和18:00解剖取優(yōu)雅蟈螽雄性成蟲頭部和精巢進行相對表達量檢測。結(jié)果如下:1.獲得優(yōu)雅蟈螽生物鐘基因per、tim、cry和cwo的完整開放閱讀框,分別命名為Ggper、Ggtim、Ggcry和Ggcwo,長度分別為3576 bp、2622 bp、1941 bp和1773 bp,分別編碼1191、873、646和590個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量分別為131.15 kDa、99.53 kDa、74.23 kDa和65.08 kDa,理論等電點pI分別為6.09、6.02、7.57和6.41。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)與其他昆蟲生物鐘基因一致性高,均在60%以上。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)均具有生物鐘基因保守的功能域,分別為GgPER的PAS結(jié)構(gòu)域、PAC結(jié)構(gòu)域、Period_C結(jié)構(gòu)域、核定位信號NLS和細胞質(zhì)定位信號CLD;GgTIM的TIMELESS結(jié)構(gòu)域、核定位信號NLS、保守區(qū)段PER-1和PER-2;GgCRY的DNA-photolyase結(jié)構(gòu)域和FAD-binding-7結(jié)構(gòu)域;GgCWO的HLH結(jié)構(gòu)域和ORANGE結(jié)構(gòu)域。進化分析結(jié)果與氨基酸序列比對結(jié)果基本一致。以上這些特點均符合生物鐘基因的特性,表明本實驗克隆獲得的4個基因?qū)儆趦?yōu)雅蟈螽生物鐘基因。2.優(yōu)雅蟈螽生物鐘基因Ggper、Ggtim、Ggcry和Ggcwo的時空表達模式分析結(jié)果:4個生物鐘基因在雌雄蟲體各發(fā)育階段均有表達且差異顯著(P0.05),若蟲期的表達量高于成蟲期,推測生物鐘基因可能在其若蟲期的蛻皮過程中起到重要作用;生物鐘基因在雌雄成體不同組織中均有表達且具有顯著差異(P0.05),同一基因在雌雄成蟲中的表達模式基本一致,推測這4個生物鐘基因在優(yōu)雅蟈螽成蟲中發(fā)揮的作用一致。3.自然光周期條件下,4個生物鐘基因在雄性成蟲頭部中均呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性表達,而在精巢中Ggper、Ggtim和Ggcry呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性表達,Ggcwo晝夜節(jié)律性不明顯。改變光周期之后,4個生物鐘基因在雄性成蟲頭部和精巢中均呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性表達且Ggcry受光周期影響較明顯。另外在自然光周期下,Ggper和Ggtim在雄性成蟲頭部和精巢中表達趨勢一致;在雄性成蟲頭部Ggcwo呈現(xiàn)晝夜節(jié)律并與Ggtim和Ggper的波動趨勢基本一致,但在精巢中不具有晝夜節(jié)律性。結(jié)合4個生物鐘基因的序列及其表達模式,本研究初步推測在優(yōu)雅蟈螽中GgPER和GgTIM結(jié)合形成異二聚體并進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用;GgCRY可能具有光信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄抑制的雙重作用;GgCWO與GgPER和GgTIM協(xié)同作用,在頭部節(jié)律性表達并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。本研究不僅為探究優(yōu)雅蟈螽鳴叫節(jié)律提供了豐富的數(shù)據(jù)資源,同時也為后期開展生物鐘基因功能方面的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

mRNA 生成和蛋白質(zhì)表達節(jié)律在時間上幾乎是相反的。過量表達的 PE per mRNA 的波動，即 PER 蛋白對其自身基因的轉(zhuǎn)錄具有負調(diào)控作用[40, mRNA 的轉(zhuǎn)錄控制和 PER 蛋白的依賴性抑制進 步完善了 PER 在這個為轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用。隨后的研究不僅支持這個轉(zhuǎn)錄反饋回路在果蠅中時間的觀點，而且表明的確存在類似情況[60]。了解生物鐘分子機制的同時，通過神經(jīng)解剖學(xué)的研究，晝夜節(jié)律的相關(guān)神受到更多的關(guān)注[61]。John Ewer 和 Brigitte Frisch 描述了 per 基因表達的側(cè)lnvs）的腹側(cè)和背側(cè)神經(jīng)元簇[62]。果蠅的腦內(nèi)有大約 150 個神經(jīng)元（圖 1晝夜節(jié)律起到重要作用[63]。然而目前，在果蠅中發(fā)現(xiàn)的分子鐘僅僅位于果的 小部分而已。過基因篩選、分子間相互作用分析、啟動子分析以及對生物鐘基因同源體發(fā)現(xiàn)更多的生物鐘基因。

圖 1-2 果蠅的生物鐘系統(tǒng)[29]Figure 1-2 The circadian system of Drosophila melanogaster蠅的第二個轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路中，涉及兩個新的轉(zhuǎn)錄因子 vri 和 pdp1εCYC 異二聚體的另外兩個直接靶點[108, 121]。CLK-CYC 通過與 E-box 結(jié)合p1ε 的轉(zhuǎn)錄，VRI 和 PDP1ε 蛋白隨之開始積累。PDP1ε 的翻譯以延遲的方ε 在深夜增加。VRI 和 PDP1ε 進入細胞核，與 clk 的啟動子內(nèi)的 I/PDP1ε-boxes）結(jié)合，VRI 抑制而 PDP1ε 激活 clk 的轉(zhuǎn)錄。當 CLK-CYC 受 pdp1ε 的轉(zhuǎn)錄也被抑制，其 mRNA 和蛋白水平也隨之減少[122]。蠅的第三條轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路中，包括 clk、cyc 和新發(fā)現(xiàn)的核心鐘基 在 CLK-CYC 的調(diào)節(jié)下有節(jié)奏地表達到峰值，并形成自己的負反饋回路。box 元件抑制其他生物鐘基因的表達，如 per 和 tim。這個負反饋回路有的晝夜振蕩。分子振蕩器精確的時間掌控及其功能而言，時鐘蛋白的翻譯后調(diào)控顯得

圖 3-2 Ggper 的 cDNA 序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 3-2 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Ggper cDNA方框內(nèi) ATG 和 TGA 分別為起始密碼子和終止密碼子。黃色、橙色和綠色區(qū)域分別是兩個 PAS 結(jié)構(gòu)域、PAC 結(jié)構(gòu)域和Period_C 結(jié)構(gòu)域。TheATG and TGAindicate the start codon and the stop codon in thebox, respectively; the domains of PAS, PAC and Period_C are shaded in yellow, orange and green,respectively.表 3-2 GgPER 的氨基酸組成Table 3-2 The amino acids composition of GgPER氨基酸Amino Acids數(shù)量Quantity含量Content氨基酸Amino Acids數(shù)量Quantity含量ContentAla (A) 65 5.5% Leu (L) 87 7.3%Arg (R) 44 3.7% Lys (K) 81 6.8%Asn (N) 53 4.5% Met (M) 36 3.0%Asp (D) 54 4.5% Phe (F) 39 3.3%Cys (C) 23 1.9% Pro (P) 90 7.6%Gln (Q) 46 3.9% Ser (S) 143 12.0%Glu (E) 90 7.6% Thr (T) 74 6.2%

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本文編號：2799191