【摘要】：生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是由于活性氧和抗氧化防御途徑不平衡所致。生物體內(nèi)的DNA、脂類和蛋白質(zhì)經(jīng)常暴露在活性氧類物質(zhì),如羥基自由基(OH·)、超氧陰離子(O_2~(-·))、單線態(tài)氧(~1O_2)和過氧化物(HOO~-)中。這些物質(zhì)可以氧化DNA造成多種損傷,包括堿基脫落、堿基氧化和單雙鏈斷裂等。8-羥基脫氧鳥苷(8-oxodGuo)是羥基自由基和單線態(tài)氧存在時最主要的DNA堿基氧化損傷產(chǎn)物。DNA復(fù)制時,8-oxodGuo可以引起堿基G:C→T:A的突變,產(chǎn)生基因或遺傳毒性。8-oxodGuo作為一種有效的DNA氧化損傷生物標(biāo)志物在很多領(lǐng)域都有研究和應(yīng)用。比如在醫(yī)療診斷領(lǐng)域中,8-oxodGuo被用于評價個體癌變幾率以及診斷與自由基相關(guān)的疾病;而在衰老機(jī)制或退行性疾病的研究中,8-oxodGuo也是主要的探討目標(biāo)。因此,構(gòu)建可以快速、靈敏檢測DNA氧化損傷的分析方法非常有必要。已經(jīng)報道的檢測DNA氧化損傷的方法很多,例如電化學(xué)傳感(光電化學(xué)、電化學(xué)、電化學(xué)發(fā)光)因檢測迅速、設(shè)備簡單、且易于實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu)點(diǎn)引起了很多科學(xué)研究者的關(guān)注。本論文主要包括兩部分內(nèi)容:第一部分綜述了DNA損傷的產(chǎn)生及檢測方法,電化學(xué)發(fā)光法分析的原理、特點(diǎn)及其應(yīng)用。第二部分為研究內(nèi)容。首先合成一種“光開關(guān)”分子作為電化學(xué)發(fā)光信號探針,在此基礎(chǔ)上引入特異性的DNA糖基化酶放大DNA損傷,構(gòu)建一種快速簡便且高靈敏的電化學(xué)發(fā)光法檢測DNA的氧化損傷。主要包括以下三個部分:1.[Ru(bpy)_2dppz]~(2+)(簡稱Ru-dppz)的合成及其與DNA的相互作用:首先利用1,10-鄰菲羅啉5,6-二酮與鄰苯二胺反應(yīng)制備聯(lián)吡啶體配合物二吡啶[3,2-a;2',3'-c]吩嗪(Dppz),產(chǎn)物Dppz再與順-雙(2,2'-二吡啶基)二氯化釕(II)二水合物(Ru(bpy)_3Cl_2)反應(yīng)制備二聯(lián)吡啶二吡啶[3,2-a;2',3'-c]吩嗪釕,Ru-dppz。接下來,分別用紫外-可見光譜法、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法對產(chǎn)物Ru-dppz進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。再對合成產(chǎn)物Ru-dppz與DNA相互作用的熒光性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)果顯示,隨著DNA的加入Ru-dppz熒光強(qiáng)度逐漸增加,說明Ru-dppz可以作為DNA分子“光開關(guān)”。通過熒光滴定實(shí)驗(yàn)得到Ru-dppz與DNA的結(jié)合常數(shù)為1.5×10~7L/mol,結(jié)合比為0.14,與文獻(xiàn)報道基本一致。2.選用上步合成的Ru-dppz為信號探針,建立一種無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光法檢測Fenton試劑造成的DNA氧化損傷。基于DNA糖基化酶Fpg(E.coli formamidopyrimidine)的雙功能性質(zhì)(識別和切除8-oxodGuo,水解磷酸二酯鍵形成切口),因此通過引入Fpg放大DNA的氧化損傷,實(shí)現(xiàn)DNA氧化損傷的高靈敏檢測。首先,考慮到Ru-dppz的電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光行為,選擇還原的氧化石墨烯(r-GO)納米金(Au)復(fù)合納米材料修飾的氧化銦錫(ITO)電極為基底電極,再將DNA組裝到電極表面,結(jié)合Ru-dppz產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號,通過檢測電化學(xué)發(fā)光信號的改變實(shí)現(xiàn)DNA的氧化損傷的檢測。同時,我們還通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)、熒光實(shí)驗(yàn)以及選擇性實(shí)驗(yàn)等證明了我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計與原理。在最優(yōu)條件下,該方法可以檢測到10 nM Fe~(2+)/40 nM H_2O_2的Fenton試劑對DNA造成的損傷,檢測靈敏度比類似的光電檢測方法提高了1000倍。本方法為DNA氧化損傷的高靈敏檢測提供了一種簡便、靈敏的方案。3.為了進(jìn)一步驗(yàn)證Fpg放大DNA氧化損傷的普遍適用性,我們研究了環(huán)境中另一種有害物質(zhì)孟加拉玫瑰紅對DNA造成的損傷。與Fenton反應(yīng)造成DNA氧化損傷機(jī)理不同的是:孟加拉玫瑰紅在光照作用下可以產(chǎn)生單線態(tài)氧。當(dāng)DNA暴露于單線態(tài)氧時,由于單線態(tài)氧的能量較低,它能夠損傷具有最低氧化電位的鳥嘌呤(G),且8-oxodGuo是其主要的損傷產(chǎn)物。采用DNA糖基化酶Fpg特異性識別并剪切8-oxodGuo的原理,檢測微量孟加拉玫瑰紅對DNA造成的氧化損傷,并研究了Fpg酶的特異性,結(jié)果顯示該方法可以檢測到0.1μg/mL的孟加拉玫瑰紅造成的DNA損傷。
【學(xué)位授予單位】：成都理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q503;O657.1
【圖文】：

圖 2-3 Ru-dppz 核磁共振氫譜圖（溶劑為 CD3CN）Fig.2-3 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of Ru-dppz (solvent CD3CN)圖 2-4 Ru-dppz 核磁共振氫譜圖（放大）Fig 2-4. Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of Ru-dppz (magnified)

17圖 2-4 Ru-dppz 核磁共振氫譜圖（放大）-4. Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of Ru-dppz (magdppz 的紫外-可見吸收光譜圖研究了 Ru-dppz 的紫外-可見吸收光譜，并對 Ru-dppz 與 DN Ru-dppz 與 DNA 都是溶解于 PB 溶液，所以使用 PB 為空測定，所得吸收光譜圖如下。

圖 2-5 Ru-dppz 與 DNA 相互作用前后的紫外可見吸收光譜圖ig.2-5 Ultraviolet-visible absorption Spectra of Ru-dppz (a)；DNA (b)；and Ru-dppz +DNA (由于如圖 2-5 所示，曲線 a 顯示 Ru-dppz 在 281 nm、368 nm、440 nm 分現(xiàn) 3 個吸收峰，與所參考文獻(xiàn)紫外吸收光譜圖的吸收峰一致（Amouyal et a990）。如曲線 b 所示為 DNA 的紫外吸收光譜，在 260 nm 處有一個很明顯收峰。如曲線 c 所示，為 DNA 與 Ru-dppz 的混合液，分別在 260 nm、281 nm68 nm、440 nm 處出現(xiàn)吸收峰，再次證明我們所合成的 Ru-dppz 制備成功。由于Ru-dppz在440 nm處的摩爾吸光系數(shù)為ε=14000 L/（mol· cm），DNA60 nm處的摩爾吸光系數(shù)為6600 L/（mol· cm），分別對Ru-dppz和DNA進(jìn)行濃正。DNA濃度以堿基對的摩爾濃度計，DNA的濃度按下式計算：[DNA]=K·A260/6600（M） （2-1式中K為稀釋倍數(shù)。測量DNA吸光度時，如DNA濃度過高，可導(dǎo)致吸光度測準(zhǔn)，一般應(yīng)稀釋到A在0.5~1之間較為合適。配置好的DNA應(yīng)在冰箱中保存?zhèn)�。同理，根�?jù)朗伯比爾定律計算得到Ru-dppz的濃度。

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本文編號：2796249