【摘要】：Pif1解旋酶作為一種依賴(lài)于ATP供能的DNA解旋酶,廣泛分布于原核生物和真核生物體內(nèi),在基因組穩(wěn)定性的維持和核酸代謝調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。釀酒酵母Pif1(Saccharomyces cerevisiae Pif1,ScPif1)解旋酶作為Pif1家族中的典型成員,是該家族中被最早鑒定并且深入研究的成員之一。體內(nèi)研究表明,ScPif1解旋酶參與端粒穩(wěn)定性的維持、岡崎片段的成熟、DNA復(fù)制過(guò)程中G4 DNA的解除以及同源重組修復(fù)等多種重要代謝途徑。體外研究則顯示ScPif1同時(shí)擁有5'-3'方向的雙鏈DNA、RNA/DNA雜交鏈以及G4 DNA的解旋活性,其中最為引人注目的是其高效的G4DNA解旋功能,在體內(nèi)條件下,G4 DNA因其高度的穩(wěn)定性而成為生物體生理代謝的一大阻礙,ScPif1通過(guò)其高效的G4 DNA解旋功能而在多種生理代謝途徑中發(fā)揮著重要作用。目前,關(guān)于ScPif1的研究主要集中在體內(nèi)或體外的生理生化實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于ScPif1結(jié)構(gòu)的研究則非常有限。本研究針對(duì)以上難點(diǎn),首先采用多序列比對(duì)的方式鑒定了ScPif1的解旋核心結(jié)構(gòu)域,并通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方式,對(duì)全長(zhǎng)ScPif1蛋白進(jìn)行了合理的截短設(shè)計(jì),通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)截短后的ScPif1~(237-780)蛋白進(jìn)行了表達(dá)純化,獲得了可用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的高純度蛋白樣品,并在隨后的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中獲得了多種DNA復(fù)合物的晶體,結(jié)合硒代蛋白晶體的反常散射數(shù)據(jù)獲得的相位,首次解析了ScPif1解旋核心結(jié)構(gòu)域的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。之后,基于解析的晶體結(jié)構(gòu),本研究綜合利用定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、凝膠過(guò)濾層析技術(shù)、X射線小角散射技術(shù)、基于熒光各向異性的DNA結(jié)合技術(shù)、快速停留FRET技術(shù)以及單分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)等多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)ScPif1的解旋核心結(jié)構(gòu)域的功能機(jī)制進(jìn)行了深入地研究,取得了如下主要成果:1)首次在ScPif1的晶體結(jié)構(gòu)中觀察到了可以特異結(jié)合ATP的保守Q基序,并通過(guò)對(duì)該基序的突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這類(lèi)基序的缺失會(huì)極大地削弱ScPif1對(duì)ATP的特異性識(shí)別功能。2)首次通過(guò)突變體實(shí)驗(yàn)揭示了ScPif1特異性結(jié)合DNA的分子機(jī)制,即His303和His705選擇性的識(shí)別DNA而不是RNA。這一發(fā)現(xiàn)從結(jié)構(gòu)上解釋了ScPif1在體內(nèi)對(duì)端粒酶的移除機(jī)制。3)通過(guò)對(duì)ScPif1多種DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合位點(diǎn)分析,首次揭示了ScPif1對(duì)鳥(niǎo)嘌呤偏好性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。ScPif1擁有的這類(lèi)鳥(niǎo)嘌呤堿基偏好性,使其可以更為有效地進(jìn)行G4 DNA的解旋。4)首次在ScPif1的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了一段存在于2B結(jié)構(gòu)域外側(cè)并具有獨(dú)特折疊模式的2C結(jié)構(gòu)域,并證實(shí)了該結(jié)構(gòu)域擁有對(duì)ScPif1解旋和易位活性的調(diào)控作用。5)首次從晶體結(jié)構(gòu)中成功鑒定出了生物學(xué)相關(guān)的二聚體形式,并在此基礎(chǔ)上提出了一種G4 DNA誘導(dǎo)的ScPif1二聚體形成機(jī)制。6)首次在晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了一段潛在的G4 DNA結(jié)合位點(diǎn),并通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該位點(diǎn)中多個(gè)氨基酸參與G4 DNA的特異性結(jié)合和解旋活性。從結(jié)構(gòu)上解釋了ScPif1所具有的G4 DNA識(shí)別機(jī)制。綜上所述,本論文通過(guò)對(duì)ScPif1解旋核心結(jié)構(gòu)的深入研究,闡明了ScPif1對(duì)多種生理底物的識(shí)別機(jī)制以及結(jié)合底物后的寡聚狀態(tài),為進(jìn)一步理解ScPif1在體內(nèi)發(fā)揮的多種功能提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q75
【圖文】：

圖 1-1 DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖示(Saini et al. 2013)Fig.1-1 The secondary structure of DNA隨著上世紀(jì) 90 年代后期晶體學(xué)的進(jìn)步，第一個(gè)源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的 DNA 解旋酶的晶體結(jié)構(gòu)被解析(Singleton et al. 2007)，隨后越來(lái)越多的解旋酶結(jié)構(gòu)被確定。這些結(jié)構(gòu)為解旋酶作用機(jī)制的研究提供了一個(gè)強(qiáng)有利的理論框架，進(jìn)一步從結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上解釋了解旋酶的各類(lèi)活性機(jī)制(Singleton et al. 2007)。1.1.1 解旋酶的特性在正常的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞里的 DNA 雙螺旋是處于熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)中的，在沒(méi)有催化劑的情況下，DNA 雙螺旋的解旋和退火是由能量和熵控制的。因此，外部能量的輸入，即增加熵（如高溫等）對(duì)于 DNA 雙螺旋的解開(kāi)是必不可少的。由于細(xì)胞不能改變其溫度或離子環(huán)境，往往依賴(lài)于解旋酶來(lái)克服堿基對(duì)熔化時(shí)所產(chǎn)生的能量障礙。根據(jù)此原理，人們普遍認(rèn)為解旋酶是通過(guò)結(jié)合并水解三磷酸核苷酸獲得能量來(lái)解離核酸結(jié)構(gòu)中的配對(duì)堿基。值得注意的是，解旋酶的這類(lèi)活性與以往定義的單鏈結(jié)合蛋白不同，單鏈結(jié)合蛋白雖然可以瞬間結(jié)合并“溶解”較短的 DNA 雙鏈，但這主要是

移動(dòng)的平均堿基數(shù)。這是一個(gè)有用且信息含量豐富的參數(shù)，因?yàn)樗粌H反應(yīng)了解旋酶的物理特性，而且還為人們理解解旋酶相應(yīng)功能提供了一定的限定條件。使用高精度的單分子實(shí)驗(yàn)證明了驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)以分散的 8 納米步幅沿著微管遷移(Schnitzer et al1997)。解旋酶的解旋過(guò)程通常包含有多種行為（例如，NTP 結(jié)合和水解，堿基對(duì)的熔解和解旋酶移位），這些行為的發(fā)生存在先后順序。對(duì)于解旋酶通常采用兩種步幅描述其解旋效率（unwinding efficiency）：分為生理學(xué)步長(zhǎng)（physical step size）和動(dòng)力學(xué)步長(zhǎng)（kinetic step size）。生理學(xué)步長(zhǎng)定義為兩次 NTP 分子水解之間解旋酶的質(zhì)量中心的移動(dòng)的堿基數(shù)。動(dòng)力學(xué)步長(zhǎng)則指解旋酶在兩個(gè)連續(xù)的限速步驟之間的平均運(yùn)動(dòng)距離。雖然它們?cè)诟拍钌虾茴?lèi)似的，但動(dòng)力學(xué)步長(zhǎng)大小可以與生理學(xué)步長(zhǎng)不同(Lucius et al. 2003)。例如，解旋酶 DNA 在消耗 1 個(gè)分子的 NTP 后前進(jìn)了 1bp 的生理學(xué)步長(zhǎng)，但因?yàn)榻庑竷?nèi)部結(jié)構(gòu)可能需要進(jìn)行分子間重排導(dǎo)致 DNA 雙鏈此時(shí)并未打開(kāi)，解旋酶會(huì)繼續(xù)消耗 NTP 前移直到 DNA 雙鏈被打開(kāi) n 個(gè) bp，此時(shí)的 n 值則為動(dòng)力學(xué)步幅。類(lèi)似現(xiàn)象已由單分子實(shí)驗(yàn)證明，如圖所示，丙型肝炎病毒（HCV）NS3 RNA解旋酶的動(dòng)力學(xué)步幅為大約 3bp，但實(shí)際的物理學(xué)步幅則為 1bp(如圖 1-2 所示)(Arunajadai et al. 2011)。

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文superfamily，SF1-5），如圖 1-3。超家族 1 和 2（SF1 和 SF2）擁有最多數(shù)量酶，其成員包括 DNA 解旋酶和絕大部分 RNA 解旋酶。SF3 解旋酶存在于 RNA 病毒中。SF4 和 SF5 是六聚體 DNA 解旋酶，分別起復(fù)制和轉(zhuǎn)錄終止因子。值得注意的是，隨后的研究發(fā)現(xiàn)這種分類(lèi)方式也存在一些不足，最重要的就不能參與核酸雙鏈解鏈但可以偶聯(lián) NTP 水解活性進(jìn)行核酸鏈遷移的“馬達(dá)”蛋gleton 等提議將與各種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的 NTP 酶類(lèi)蛋白歸屬為第六個(gè)家族（SF6就是 AAA+類(lèi)(Singleton et al. 2007)。由于本文所研究的 Pif1 蛋白屬于 SF1 解旋此這里我們著重介紹 SF1 解旋酶的一般特征。

本文編號(hào)：2796372