發(fā)布時間：2020-08-17 17:49

【摘要】：背景:生命科學的進步與發(fā)展離不開成像儀器的開發(fā)與成像技術的突破。如何通過成像技術來檢測、分析生物大分子的各種變化,從中提取分子信息,定性、定量這些生物大分子等都具有重要的科學意義和應用價值。AFM以微懸臂作為力學信號媒介可直觀展現(xiàn)生物大分子的超精細結構和各種物化性質(zhì),大大提高了我們對蛋白質(zhì)結構和其在生化反應中所扮演角色的理解,為解決生物大分子功能和分子層面生理行為的生化問題提供了新的技術手段。目的:本研究旨在運用多模態(tài)AFM建立生物大分子檢測與生物大分子互作研究平臺的新方法。一是開發(fā)針對超痕量生物毒素的無標記甄別方法;二是建立在近生理條件下原位動態(tài)研究毒素生物學效應的新平臺;三是與DNA折紙技術結合,通過設計毒素-DNA標簽嵌合分子,對室溫條件下的嵌合分子可控自組裝行為進行前期先導研究,為進一步探索毒素受體與作用機制奠定基礎。方法:1.在超痕量生物毒素無標記檢測部分,選用ABR,RT,ETX,BoNT/A和SEB這5種生物毒素做為模型,分別進行提取純化,并通過APTES修飾的云母進行表面固定,經(jīng)過實驗條件的優(yōu)化使毒素蛋白在云母表面以單分子顆粒的形態(tài)沉積。首先采用AFM和PiFM對毒素單分子顆粒進行形貌與PiF反饋的成像,并以此對基底、緩沖液中鹽成分和蛋白進行定性。其次收集各毒素蛋白顆粒的PiF譜,參考傅里葉變換紅外吸收譜中酰胺帶的吸收峰,篩選出10個與蛋白二級結構相關的特征PiF吸收帶,并對這些信號帶的峰位與強度做PCA分析。通過PCA的結果聚類每種毒素蛋白,構建針對每種毒素蛋白的單分子PiF譜數(shù)據(jù)庫。最后混合三種毒素蛋白制作模擬樣品,并對模擬樣品進行PiFM表征,在一定區(qū)域收集模擬樣品的PiF譜,將PiF譜導入先前構建好的毒素PCA模型,最終鑒定其所包含的毒素蛋白成分。2.在生物毒素原位動態(tài)成像研究部分,針對能夠使人血紅細胞具有成孔效應的ETX蛋白為研究模型,通過低滲緩沖液滋洗的方式制備單層人血紅細胞外膜與內(nèi)膜,運用環(huán)境可控的AFM平臺在近生理條件下原位動態(tài)的觀察ETX與內(nèi)外膜的相互作用,表征毒素在不同溫度,不同膜區(qū)域內(nèi)成孔的特性,運用AFM探針分別表征完整紅細胞膜與成孔紅細胞膜的力學差異。結合重組紅色熒光mScar ETX,通過共聚焦分析ETX受體在紅細胞膜表面的分布。3.在生物毒素可控自組裝研究部分,采用重組表達的方法設計N末端含有一個Cystein殘基linker的c-linker-ETX蛋白,構建相應的原核表達載體行蛋白可溶性表達,純化該重組c-linker-ETX,與末端修飾馬來酰亞胺的寡核苷酸序列形成1對1的蛋白-核酸嵌合體蛋白,命名為DNA-c-linker-ETX,通過溶血實驗與CD實驗對比DNA-c-linker-ETX與rETX之間有無溶血和二級結構的差異。通過AFM原位觀察4種不同結構的矩形DNA折紙(DNA origami)在室溫下自組裝的動力學特征,探討origami缺損面積與結構特點對其室溫下的合成與效率的影響。為研究ETX蛋白的可控組裝奠定基礎。結果:1.建立了超痕量生物毒素無標記檢測方法。經(jīng)過表面修飾與蛋白濃度優(yōu)化,成功地在云母載片上制備了單分子毒素顆粒的樣品,AFM表征與粒徑分析均與參考蛋白結構和分子量所做的預期相一致。其中用BoNT/A代表大分子蛋白,ABR與RT代表中等大小分子蛋白,ETX與SEB代表小分子蛋白。氣相條件下BoNT/A粒徑在10 nm左右,ABR與RT在5 nm左右,ETX與SEB在2.5 nm左右。隨后對每種毒素樣品進行單波長PiFM表征,通過云母基底PiF信號的反轉(zhuǎn)對基底上的蛋白顆粒分布進行了定性區(qū)分。對成像區(qū)域內(nèi)的蛋白顆粒光誘導力譜的收集和PCA分析,將5種毒素蛋白進行了很好的聚類,以其中ABR、RT、ETX為例制備混合模擬樣品,經(jīng)收集PiF譜和PC分析,檢測模擬樣品中三種毒素蛋白ABR:RT:ETX的信號比分別為9:35:55,該檢測值位于真實值(11:38:131)與理論值(2:3:5)之間。與傅里葉變換紅外譜相比,光誘導力譜在酰胺信號帶的分辨率更高且能直接顯示代表蛋白二級結構歸屬的信號帶。通過對每種毒素的PiFM成像比較發(fā)現(xiàn),ETX與SEB的光誘導信號反饋遠小于ABR,RT和BoNT/A,顯示該檢測體系對于分子量小于30 kDa的蛋白樣品檢測的不足。但可以將云母基底替換成增強Au基底加以改善。2.完成了對成孔蛋白ETX成孔效應的原位動態(tài)成像研究。Western blot實驗與掃描電鏡提示天然狀態(tài)下ETX形成七聚體復合物與人紅細胞膜相互作用,在紅細胞膜表面成孔并破壞膜的完整性。高分辨AFM在近生理條件下原位觀察了人紅細胞膜孵育ETX后的形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)ETX只對人紅細胞外膜具有成孔效應,其中通過環(huán)境可控AFM的動態(tài)成像發(fā)現(xiàn)當溫度高于23℃時6μg/mL的rETX才使紅細胞膜外成孔,而隨著溫度下降到23℃以內(nèi),成孔效應將停止。此外還觀察到,ETX作用下,膜的完整性隨時間而降低。通過制備“水泡”樣結構的紅細胞膜模型,顯示ETX對于死細胞膜也具有成孔效應。3.對基于DNA折紙術的生物毒素單體可控自組裝體系進行了前期研究。我們成功構建了位點特異性的DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,發(fā)現(xiàn)該嵌合策略不會對ETX的溶血活性及二級結構產(chǎn)生影響;對室溫下自組裝的DNA納米結構的動力學特征研究發(fā)現(xiàn),“接縫”結構能引導短鏈完成預退火形成的缺損DNA origami的生長。其正確折疊的效率與缺損的面積和預組裝的結構相關。在“接縫”結構存在的條件下,1/4缺損的矩形origami能夠在室溫下獲得90%的修復率。結論:本研究圍繞多模態(tài)AFM在生物大分子檢測、生物效應和納米結構組裝方面做出新的探索。首先,通過PiFM與PCA組合的策略,建立了蛋白毒素單分子無標記痕量檢測方法,實現(xiàn)了對ABR,RT,ETX三種混合模擬毒素的甄別,并構建了ABR,BoNT/A,RT,ETX,SEB五種分子量不同、分子大小有別的生物毒素單分子PiF譜數(shù)據(jù)庫;其次,應用高分辨AFM在近生理環(huán)境下對ETX蛋白與人血紅細胞的成孔效應進行了原位、動態(tài)的表征。AFM結果顯示在這個過程中ETX對紅細胞內(nèi)膜不產(chǎn)生成孔效應,且在無ATP活動的單層人血紅細胞膜上同樣能夠完成與膜的特異性結合。AFM對成孔紅細胞膜的高分辨成像未給出ETX七聚體復合物是構成紅細胞膜表面孔洞的直接證據(jù)。最后,基于DNA折紙術設計并成功構建了DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,為下一步定量,可控的研究ETX七聚體在成孔過程中的角色提供了有力的工具,也為下一步研究生物大分子在生理條件下與origami的定向排列與功能驗證提供理論基礎。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q-336
【圖文】：

圖 1AFM 工作示意圖a）典型的力-距離曲線示意圖，反映了探針與樣品表面的相互作用力，通過施加于針尖的 F 可以計算出樣品的彈性模量 E；b）AFM 工作狀態(tài)下探針針尖的力曲線示意圖；c）輕敲模式下 AFM 探針掃描樣品表面，實時獲得力反饋�；诓煌膽眯枰珹FM 發(fā)展出靜態(tài)的成像模式（也稱為接觸）模式和各種動態(tài)（非接觸或 輕敲 ）模式：1，輕敲模式 AFM，通過使用處于振動狀態(tài)的探針針尖對樣品表面進行敲擊來生成形貌圖像。掃描過程中，探針懸臂的振幅隨樣品表面形貌的起伏而變化，從而反映出形貌的起伏。其優(yōu)點是消除了會對樣品造成損傷并降低圖像分辨率的橫向力影響，并且可以不受成像環(huán)境下樣品表面附著的水膜的影響。缺點是掃描速度比接觸模式稍慢一些。2，接觸模式 AFM，探針針尖始終與樣品表面保持接觸。當掃描管引導針尖在樣品上方掃過（或樣品在針尖下方移動）時，懸臂梁受力發(fā)生彎曲，從而反映出形貌的起伏。其優(yōu)點是可以達到很高的分辨率，缺點是有可能對樣品表面造成損壞，橫向的剪切力和表面

和產(chǎn)氣莢膜溶血素(Perfringolysin O)研究較為深入。Shao 等通過 AFM 對霍亂毒素和產(chǎn)氣莢膜溶血素在磷脂層上自組裝成像使我們可以直觀的看到霍亂毒素 5 個 β亞基聚體中間約2 nm的孔洞（圖2 a）；PFO的成像對膽固醇依賴性溶細胞素（CDCs）的成孔前體的跨膜機制帶來直接證據(jù)[18,19]（圖 2 b）。圖 2 成孔毒素在磷脂層成孔的 AFM 成像a）磷脂雙分子層上的霍亂毒素 B 亞單位五聚體 AFM 成像[18]；b）磷脂雙分子層上的產(chǎn)氣莢膜溶素（PFO）孔復合物 AFM 成像[19]PFO 作為 CDCs 成孔的模型的代表，其成孔機制已研究的較為清楚，F(xiàn)eil 等

圖 3 PFO 與 ETX 單體晶體結構PFO 具有四個結構域 D1，D2，D3，D4；ETX 具有 3 個結構域 D1，D2，D3如圖 4 所示，近年來利用 DNA 分子組裝納米形狀和圖案被用來制造納米工具被越來越多的應用在生命科學領域[28-30]。模塊化的 DNA 單元通過與功能化的蛋白質(zhì)嵌合，可以在相對獨立的體系內(nèi)定性定量的展示單分子蛋白的生化信息，比如轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 的結合[31]，酶對核酸的剪接[32]和單體蛋白的功能性聚合[33]在這些例子當中DNA鏈為蛋白質(zhì)提供了機械剛性和相對較高的物理化學穩(wěn)定性此外通過引入各種酶切位點，利用一系列高度特異性的 DNA 酶，就能夠間接地的處理和操縱嵌合分子，并通過 AFM 予以表征。

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