【摘要】：熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)是多種冷藏水產(chǎn)品的特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism,SSO),它能夠在低溫環(huán)境下生長繁殖并產(chǎn)生極耐熱的蛋白酶和脂肪酶,引起食品腐敗變質(zhì)。P.fluorescens還能產(chǎn)成大量的生物被膜,幫助細菌躲避不利因素的危害并使細菌形成耐藥性。生物被膜一旦形成,則很難徹底去除,給食品安全造成巨大威脅。在食品加工過程中進行普通的消毒對除去生物被膜是無濟于事的,由于細菌會對殺菌劑的抵抗力不斷增強,因此需要發(fā)展新的方法來控制細菌產(chǎn)生的生物被膜以及對食品的致腐能力。研究表明,熒光假單胞菌的多種與食品腐敗相關(guān)的特性都受到其群體感應(yīng)(Quorum Sensing,QS)系統(tǒng)的調(diào)控。因此,尋找群體感應(yīng)抑制劑(Quorum Sensing Inhibitor,QSI)來干擾QS所參與或調(diào)控的生理活動,可能為消除細菌的耐藥性、延長食品的貨架期提供可能的途徑。但是,傳統(tǒng)方法來尋找QSI往往是隨機的,效率低、成本高,且需要大量的實驗,而計算機輔助篩選QSI則恰好可以解決這一問題。鑒于此,本研究以熒光假單胞菌為研究對象,以其QS系統(tǒng)為靶點,通過同源建模、虛擬篩選、分子對接等方法,更加直觀、便捷地尋找新的QSI,并對其抑制機理進行探究,最后,將篩選到的QSI與靜電紡絲技術(shù)結(jié)合,將其應(yīng)用到水產(chǎn)品保鮮中,為探究熒光假單胞菌的QS系統(tǒng)調(diào)控的致腐機理以及尋找新的延長水產(chǎn)品貨架期、增強水產(chǎn)品安全性的方法提供參考。主要結(jié)果如下:(1)通過對熒光假單胞菌進行全基因組測序及基因注釋,得到了其QS系統(tǒng)的LuxI型和LuxR型蛋白的氨基酸序列。通過同源建模方法得到了受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)。用SAVES、QMEAN等方法對所建的蛋白模型的質(zhì)量進行評價,發(fā)現(xiàn)所建的蛋白模型具有較好的質(zhì)量。(2)以LuxI型和LuxR型蛋白為對接靶點,從傳統(tǒng)中藥化合物數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中篩選潛在的QSI。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有10種物質(zhì)具有群體感應(yīng)抑制活性(命中率66.67%)。苯甲醇、甲酸玫瑰酯、玫瑰醇和魚腥草素等物質(zhì)具有很強的QS抑制活性。活性最強的苯甲醇對P.fluorescens P07的群體感應(yīng)表型具有顯著的抑制效果。分子對接技術(shù)分析其對QS系統(tǒng)的抑制機理,發(fā)現(xiàn)苯甲醇的抑制機理可能是由于其緊密地結(jié)合到LuxI型蛋白中,從而阻斷了P.fluorescens P07信號分子的產(chǎn)生并阻斷了其QS通路,從而達到抑制的效果。(3)為了篩選更加安全高效的QSI,我們以LuxI型和LuxR型蛋白為對接靶點,從食物組分數(shù)據(jù)庫中篩選潛在的QSI。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有19種物質(zhì)具有QS抑制活性(命中率76.00%)。其中,(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、沒食子酸丙酯、橙皮苷、番茄紅素以及茄尼醇等物質(zhì)具有很強的QS抑制活性。具有最強QS抑制活性的(+)-兒茶素對P.fluorescens P07的胞外蛋白酶產(chǎn)生、泳動性、生物被膜以及EPS的形成具有顯著的抑制效果。(4)分別用基于分子相似性、基于配體和受體藥效團模型的方法,從ChEBI、ChEMBL、中藥數(shù)據(jù)庫(TCM Database@Taiwan)和ZINC天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中篩選P.fluorescens P07的QSI。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了丙酸-2-苯乙酯、和厚樸酚、厚樸酚、尼泊金乙酯、姜酮、愈創(chuàng)木酚、辛可尼丁、水楊苷、檸檬醛、香蘭素、褪黑素、10-十一烯酸以及(L)-(+)-酒石酸二乙酯等具有較強的QS抑制活性的物質(zhì)。(5)用具有較強QS抑制活性的香蘭素處理P.fluorescens P07并檢測其對細菌的群集性、生物被膜以及EPS的影響,并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究其抑制機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),香蘭素對于P.fluorescens P07的群集性、生物被膜以及EPS均具有顯著的抑制效果。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測試發(fā)現(xiàn)經(jīng)香蘭素處理后,細菌的差異表達基因上調(diào)的有92個,下調(diào)的有87個。細菌生物被膜的減少是香蘭素對細菌的運動性、粘附性、趨化性、EPS的含量以及QS系統(tǒng)等多種因素影響所致。(6)通過將靜電紡絲技術(shù)與篩選到的QSI相結(jié)合,制備了PLA 沒食子酸丙酯以及PCL 表兒茶素同軸靜電紡絲纖維,對制備的納米纖維進行表征并測試其對冷藏條件下三文魚片中P.fluorescens P07的致腐性的抑制效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),制備的靜電紡絲纖維直徑較小,表面光滑,無串珠及其他缺陷,并具有核-殼結(jié)構(gòu)。通過對紡絲纖維的性能進行表征,發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性、拉伸強度等性能均能滿足冷藏條件需要,且纖維能很好地包裹QSI并具有緩釋行為。載有QSI的紡絲纖維在沒有抑制三文魚片中細菌的生長的前提下,對魚片中揮發(fā)性鹽基氮(Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N)、三甲胺(Trimethylamine,TMA)以及細菌水溶性胞外多糖的生成能力都顯示了顯著的抑制效果,并顯著延緩了三文魚片中Ca~(2+)-ATPase活性的降低速度和三文魚片肌肉組織的劣變速度。載有QSI的紡絲纖維對細菌的致腐能力也有顯著的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3
【圖文】：

圖 1-1 革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的 QS 信號分子基高絲氨酸內(nèi)酯，AHL；2：N-3-羥基�；�-高絲氨酸內(nèi)酯（3-hydroxy-絲氨酸內(nèi)酯（3-oxo-AHL）；4：呋喃糖基硼酸二酯，AI-2；5：PQS；6：8：金黃色葡萄球菌自誘導(dǎo)肽，AIP-1.Fig.1-1 QS signal molecules of Gram-negative and Gram-positive bacteri1: N-acyl homoserine lactone (AHL); 2: N-(3-hydroxyacyl) homoserine lacl)-l-homoserine lactone; 4: Furanosyl borate ester form (AI-2); 5: Pseudom; 6: Diffusible signalling factor (DSF); 7: Hydroxyl-palmitic acid methyl esAutoinducing peptide (AIP-1) of Staphylococcus aureus. QS 系統(tǒng)氨酸內(nèi)酯是很多革蘭氏陰性細菌QS系統(tǒng)的信號分子[10]。AH也被稱為 LuxI/R 型 QS 系統(tǒng)，是人們最早發(fā)現(xiàn)也是研究最為。目前已經(jīng)在近 100 種革蘭氏陰性細菌中發(fā)現(xiàn)存在此系統(tǒng)[11- luxI/R 調(diào)控基因組成。其中，luxI 為信號分子合成酶表達基表達基因。在 AI-1 型 QS 系統(tǒng)中，信號分子的合成途徑為：及 AinS 等蛋白酶的催化作用下，酰基化的�；d體蛋白和

靶基因轉(zhuǎn)錄的目的，其作用機制如圖 1-2 所示。然菌的 QS 系統(tǒng)沒有 luxI 基因及其指導(dǎo)合成的 LuxI含有 LuxR 蛋白類似物（SdiA），能感知其他菌群明 AHL 不僅與細菌種內(nèi)的信息交流有關(guān)，而且與

QS 系統(tǒng)分子還有其他種類，如在腸出血性大腸桿菌中還發(fā)現(xiàn)能調(diào)控 AI-3 型信號分子[19]。AI-3 型 QS 系統(tǒng)較前兩種系統(tǒng)調(diào)控過性菌的 QS 系統(tǒng)類分子（autoinducter peptide, AIP）作為 G+菌的 QS 系統(tǒng)的信號傳遞，因此，AIP 介導(dǎo)的 QS 系統(tǒng)是革蘭氏陽性細菌交的 AIP，通常由氨基酸殘基數(shù)為 5~10 個的環(huán)狀寡肽經(jīng)修飾肽類分子大小各異，且其不能自由透過細菌的細胞壁，因此轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（ATP-binding-cassette）的協(xié)助將 AIP 轉(zhuǎn)運到細胞圖 1-4 所示。AIP 信號分子與 AHLs 相似，隨細菌濃度的增當其在環(huán)境中積累達到閾值時，寡肽類信號分子與膜上的信位于細胞膜上的組胺酸蛋白激酶，進而激酶中組氨酸殘基磷酶與胞內(nèi)應(yīng)答調(diào)節(jié)子的天冬氨酸殘基結(jié)合，使之磷酸化并被節(jié)子通過調(diào)控 AIP 基因、受體激酶、應(yīng)答調(diào)節(jié)子基因以及從而起到調(diào)控的功能[21]。

本文編號：2795607