【摘要】：鹵醇脫鹵酶(HHDHs)通過(guò)分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化鄰鹵醇水解轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物,也可以接受不同的親核試劑如CN~-、N_3~-、NO_2~-等催化環(huán)氧化物的開(kāi)環(huán)反應(yīng),在處理有機(jī)鹵化物污染物和合成手性藥物中間體方面有著極高的研究?jī)r(jià)值。其中鹵醇脫鹵酶HheC的活性中心包埋在酶分子內(nèi)部,由四個(gè)Loop片段環(huán)繞而成,包括底物結(jié)合口袋和鹵離子結(jié)合位點(diǎn)。先前的研究表明:1.鹵離子的釋放是催化脫鹵反應(yīng)中的限速步驟;2.Loop3片段為鹵離子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域,在催化過(guò)程中對(duì)鹵離子的結(jié)合和釋放起到了關(guān)鍵作用,且該過(guò)程伴隨有構(gòu)象變化的發(fā)生;3.Loop4片段也被證明對(duì)催化活性和熱穩(wěn)定性有著顯著調(diào)控作用。目前對(duì)Loop1和Loop2區(qū)域并沒(méi)有進(jìn)行深入探索,且對(duì)整個(gè)酶活性中心的構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也沒(méi)有具體闡述。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段與計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合對(duì)酶催化過(guò)程中的構(gòu)象變化和鹵離子通道結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行較為系統(tǒng)研究,從蛋白質(zhì)柔性變化的角度對(duì)上述關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行了闡述。通過(guò)丙氨酸掃描找到Loop1和Loop2上對(duì)活性影響較大的關(guān)鍵位點(diǎn)D80,I81,F82,P84,F86,T134,W139和L142,其中D80A,I81A,F82A三個(gè)突變體無(wú)明顯活性;其余五個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)楸彼岷蠡钚跃?倍以上的顯著提升。構(gòu)建關(guān)鍵位點(diǎn)的飽和突變文庫(kù)并進(jìn)行活性篩選,結(jié)果表明D80,I81,F82三個(gè)位點(diǎn)未檢測(cè)到有明顯活性的突變體,表明這三個(gè)氨基酸對(duì)酶發(fā)揮催化功能的重要性;其余五個(gè)位點(diǎn)的飽和突變文庫(kù)中篩選到了活性有不同程度提升的突變體。為了進(jìn)一步探究構(gòu)象變化對(duì)酶活性的影響,將位于同一Loop環(huán)上的關(guān)鍵位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)突變體進(jìn)行疊加,得到了一系列酶活性提高6-15倍的疊加優(yōu)勢(shì)突變體。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬技術(shù)對(duì)上述優(yōu)勢(shì)突變體的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)對(duì)氨基酸之間的相互作用力進(jìn)行分析。結(jié)果表明:關(guān)鍵位點(diǎn)的丙氨酸突變體P84A,F86A,T134A,W139A和L142A以及W139的一系列優(yōu)勢(shì)突變體的活性中心柔性增加,推測(cè)可能是通過(guò)減小殘基側(cè)鏈,使得活性空間變大,且與周圍氨基酸的相互作用減弱,有利于蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,進(jìn)而導(dǎo)致酶的催化活性大大升高。該推斷在多個(gè)活性提高的疊加突變體中(如P84A-F86A)也得到進(jìn)一步證明。綜上所述,底物結(jié)合口袋或者鹵離子結(jié)合位點(diǎn)處Loop的柔性改變是酶活性升高的主要原因。通過(guò)對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬得到鹵離子從活性中心釋放到溶劑中的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析得到了處于不同時(shí)刻的Br-位置,得到其周圍可能相互作用的氨基酸,并對(duì)鹵離子的釋放通道進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Loop1區(qū)域上的F82-P84位點(diǎn),Loop3區(qū)域上的P175-L178和Y185-Y187位點(diǎn),Loop4的W249以及F12位點(diǎn),對(duì)鹵離子釋放起到了關(guān)鍵作用。三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)也表明,這些位點(diǎn)在鹵離子釋放前后構(gòu)象發(fā)生了較大改變。由此得出,這些氨基酸可能參與鹵離子釋放過(guò)程中所伴隨的構(gòu)象變化,相關(guān)研究可以對(duì)后續(xù)的鹵醇脫鹵酶改造奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q814
【圖文】：

電子科技大學(xué)碩士學(xué)位論文留了與 SDRs 家族類似的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu) Ser132-Tyr145-Arg149：酪氨酸 Tyr 從底物的羥基中奪取一個(gè)質(zhì)子，底物中的氧原子對(duì)臨近的鹵代碳原子親核攻擊形成環(huán)氧化物和鹵離子。其中絲氨酸 Ser 通過(guò)形成氫鍵穩(wěn)定底物，精氨酸 Arg 則可以降低酪氨酸的 pKa值。奪取的質(zhì)子則通過(guò) Arg、水分子以及酶表面的 80Asp 釋放到溶劑中去[13,17,18]，如圖 1-1b 所示。鹵離子則從底物結(jié)合口袋移動(dòng)至鹵離子結(jié)合位點(diǎn)，再?gòu)慕Y(jié)合位點(diǎn)處釋放到外部溶劑中去。(a) (b)

p3 和 Loop4 區(qū)域關(guān)鍵氨基酸以及 F12 位點(diǎn)與 Cl-結(jié)合的三維酶的應(yīng)用特有的催化性能使其在工業(yè)上倍受重視。研究表明鹵鍵斷裂的脫鹵反應(yīng)，應(yīng)用于有毒外源生物的生物1,2,3-三氯丙烷或去除食品加工過(guò)程中形成的 3-氯類化合物[22,23]；還能作為催化劑應(yīng)用于生物催化領(lǐng)-、N3-、NO2-等，催化環(huán)氧化物的開(kāi)環(huán)反應(yīng)來(lái)合成代醇等化合物[24]。其中比較重要的無(wú)疑是合成 Lipit主要活性成分為阿托伐他汀）的活性中間體 R-4-氰映如圖 1-3 所示：第一步是利用酮還原酶（KRED乙酸生成 S-4-氯-3-羥基丁酸；第二步是利用鹵醇脫度下與 HCN 反應(yīng)，催化氰基取代氯取代基。天然不足以滿足大規(guī)模應(yīng)用，因此對(duì)鹵醇脫鹵酶的催化

圖 1-3 阿托伐他汀的活性中間體 R-4-氰基-3-羥基丁酸酯的合成反應(yīng)，其中括號(hào)內(nèi)代表阿托伐他汀的結(jié)構(gòu)式1.3 鹵醇脫鹵酶 HheC 的改造為了使鹵醇脫鹵酶 HheC 更好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，需要對(duì)其酶活性進(jìn)行改造。酶工程是當(dāng)今生物技術(shù)領(lǐng)域的重要組成部分，隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程的崛起，對(duì)酶的改造也開(kāi)始變得多樣化。運(yùn)用基因工程可以通過(guò)增加編碼該酶質(zhì)粒的拷貝數(shù)，啟動(dòng)子工程等來(lái)提高微生物的產(chǎn)酶量，這一原理也已成功地應(yīng)用于解決酶效率低下的問(wèn)題[5]。然而這些策略并不能克服酶本身的缺陷，蛋白質(zhì)工程的出現(xiàn)很大程度上解決了這一問(wèn)題。蛋白質(zhì)工程的目的是通過(guò)改變蛋白質(zhì)的序列從而改變其結(jié)構(gòu)，創(chuàng)造出具有更好的功能特性的酶，如穩(wěn)定性、活性、反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用以及對(duì)非天然底物的選擇性。例如在以酶的固定化為核心的發(fā)酵工程中，人們對(duì)酶自身的特點(diǎn)研究后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)酶做一些細(xì)微的改變，可以使酶在保持原有的優(yōu)良特性的前提下，更加符合工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，如生產(chǎn)出穩(wěn)定性極強(qiáng)、耐高溫的酶[2,3,5,28]。在起始階段，主要采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行改造。如 Shanklin 發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)不飽和

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本文編號(hào)：2782321