【摘要】：研究背景免疫檢查點(diǎn)阻滯劑的應(yīng)用是腫瘤治療領(lǐng)域的一大突破,它已在多種腫瘤類型中取得了令人振奮的臨床療效。目前,美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)6種靶向CTLA-4、PD-1或PD-L1的單克隆抗體用于12種臨床腫瘤指征。不幸的是,只有10-40%的腫瘤患者能從中獲益。PD-1/PD-L1阻滯療效不佳通�？蓺w因于腫瘤微環(huán)境內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞有限。溶瘤病毒代表另外一種新興的腫瘤免疫療法,它主要通過選擇性的裂解腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其發(fā)生免疫原性死亡,釋放大量的腫瘤相關(guān)抗原、病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式,從而促進(jìn)抗原提呈,募集T細(xì)胞,使T細(xì)胞致敏。此外,溶瘤病毒引起的Ⅰ型干擾素反應(yīng),亦可產(chǎn)生趨化因子,募集周圍的T細(xì)胞�；诿庖邫z查點(diǎn)阻滯劑和溶瘤病毒治療不同的作用機(jī)制,我們探討了二者聯(lián)合使用的新策略及其是否可以產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)。方法我們首先利用分子克隆和同源重組技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)抗人PD-1單克隆抗體的新型溶瘤性Ⅱ型單純皰疹病毒(oHSV2-aPD1)。應(yīng)用蛋白免疫印跡和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),我們檢測了 oHSV2-aPD1病毒產(chǎn)生PD-1單抗的能力及表達(dá)的PD-1單抗的生物學(xué)功能。通過病毒感染實(shí)驗(yàn)和CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),我們比較了未經(jīng)抗體修飾的親代溶瘤病毒oHSV2和表達(dá)抗人PD-1單抗的子代病毒oHSV2-aPD1的感染能力及體外溶瘤活性。應(yīng)用B16R小鼠黑色素瘤模型,我們探討了 oHSV2-aPD1病毒的體內(nèi)抗腫瘤效果。此外,利用流式細(xì)胞術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),我們進(jìn)一步探索了 oHSV2-aPD1病毒療法對(duì)腫瘤微環(huán)境和機(jī)體系統(tǒng)免疫狀態(tài)的影響。結(jié)果(1)我們成功構(gòu)建了表達(dá)抗人PD-1單克隆抗體的新型溶瘤性Ⅱ型單純皰疹病毒,oHSV2-aPD1。(2)通過感染真核細(xì)胞,oHSV2-aPD1病毒表達(dá)出了分子量大小正確的抗人PD-1單克隆抗體,該抗體能識(shí)別人源PD-1抗原并與之結(jié)合,活化T細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-y和IL-2的合成。(3)oHSV2-aPD1病毒同親代病毒oHSV2相比,溶瘤譜未發(fā)生改變,溶瘤活性亦未被削弱。(4)在小鼠B16R黑色素瘤模型中,oHSV2-aPD1病毒療法獲得了與聯(lián)合治療(局部應(yīng)用oHSV2病毒+系統(tǒng)應(yīng)用抗人PD-1單抗)相似的抗腫瘤效果,并且這種療效無論是在抑制腫瘤生長還是延長小鼠生存期方面,都優(yōu)于單獨(dú)治療(單獨(dú)oHSV2或抗人PD-1單抗治療)。(5)oHSV2-aPD1病毒治療激活了機(jī)體腫瘤微環(huán)境和外周免疫系統(tǒng)內(nèi)大量的免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子,并且減少了免疫抑制性細(xì)胞的比例。(6)機(jī)體外周免疫狀態(tài)與腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫狀態(tài)相比,與腫瘤免疫治療療效有更好的相關(guān)性。結(jié)論我們的研究表明,oHSV2-aPD1病毒療法在臨床前動(dòng)物腫瘤模型中展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性和持久的療效反應(yīng),提示表達(dá)免疫檢查點(diǎn)阻滯劑的溶瘤病毒在腫瘤臨床治療中具有很大潛力。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;R730.51
【圖文】：

逑大小為６２９３邋５？，大于空載質(zhì)粒？１１０５２（１３４．５邋（分子量為４４９９邋５？），所以挑選的１－７逡逑號(hào)和９－１２號(hào)克隆均可能為正確的ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒（圖３ａ），我們選擇逡逑１－４號(hào)克隆進(jìn)行后續(xù)酶切鑒定。成功的順式連接質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ經(jīng)ＥｃｏＲ逡逑Ｉ和Ａｇｅ邋Ｉ內(nèi)切酶雙酶切為５５６５邋ｂｐ和７２８邋ｂｐ兩個(gè)片段；成功的反式連接質(zhì)粒逡逑ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ邋經(jīng)邋ＥｃｏＲ邋Ｉ邋和邋Ａｇｅ邋Ｉ邋雙酶切為邋５２０３邋ｂｐ邋和邋１０９０邋ｂｐ邋兩片段，所逡逑以１號(hào)和３號(hào)克隆可能為正確的順式連接ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒（圖３ｂ）。逡逑經(jīng)一代測序驗(yàn)證，１號(hào)克隆序列正確且無堿基突變，我們將其作為陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)逡逑增，獲得了邋ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ邋質(zhì)粒。逡逑接下來我們利用ＤＮＡｚｏｌ試劑提取了邋0ＨＳＶ２病毒基因組，然后利用磷酸鈣微逡逑沉淀轉(zhuǎn)染法，將0ＨＳＶ２病毒基因組和穿梭質(zhì)粒ＰＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ共同轉(zhuǎn)染進(jìn)逡逑入病毒生產(chǎn)細(xì)胞。0ＨＳＶ２病毒在復(fù)制過程中，約有十萬分之一的概率與ｐＨＧ５２ｄ３４．５－逡逑ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒發(fā)生同源重組，從而使ＣＭＶ－ｅＧＦＰ表達(dá)序列替換掉ｏＨＳＶ２病毒基逡逑因組中ＩＣＰ３４．５基因表達(dá)序列

入病毒生產(chǎn)細(xì)胞。0ＨＳＶ２病毒在復(fù)制過程中，約有十萬分之一的概率與ｐＨＧ５２ｄ３４．５－逡逑ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒發(fā)生同源重組，從而使ＣＭＶ－ｅＧＦＰ表達(dá)序列替換掉ｏＨＳＶ２病毒基逡逑因組中ＩＣＰ３４．５基因表達(dá)序列，得到少量的ｏＨＳＶ２－ｅＧＦＰ（ＩＣＰ３４．５位）病毒（圖４）。逡逑通過在熒光顯微鏡下進(jìn)行多輪的挑選純化，最終獲得無0ＨＳＶ２病毒混雜的ＯＨＳＶ２－逡逑ｅＧＦＰ邋（ＩＣＰ３４．５邋位）純病毒。逡逑ｆｍｍｍ邐ＨＩ逡逑■邐■逡逑圖３穿梭質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ的構(gòu)建逡逑（ａ）線性質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５與ＣＭＶ－ｅＧＦＰ片段連接產(chǎn)物的基因組分子量分析。Ｌａｎｅ邋Ｍ２：挑選逡逑的卜１２號(hào)克��；Ｎ：陰性質(zhì)控，環(huán)形質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５。（ｂ）線性質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５與ＣＭＶ－ｅＧＦＰ逡逑片段連接產(chǎn)物的酶切鑒定。Ｌａｎｅ邋１－４：挑選的１－４號(hào)克隆經(jīng)ＥｃｏＲ邋Ｉ和Ａｇｅ邋Ｉ雙酶切產(chǎn)物；Ｎ１、逡逑Ｎ２：邋ＥｃｏＲＩ單酶切載體質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５產(chǎn)物。Ｍ：邋ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下電泳條帶分子逡逑量依次為邋１０、８、６、５、４、３、２、１、０．８、０．５邋和邋０．３邋ｋｂ。逡逑４４逡逑

逑（圖７），一代測序結(jié)果證明序列正確且無堿基突變。至此，我們成功構(gòu)建了邋0ＨＳＶ２－逡逑ａＰＤｌ病毒，圖８所示即為病毒構(gòu)建總體示意圖。逡逑Ｐｈａｓｅ邐－邐Ｉ：逡逑圖６同源重組成功的ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ病毒形成的噬毒斑（２０0ｘ）逡逑圖７邋ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ病毒抗體基因修飾序列的ＤＮＡ梯度分析逡逑Ｌａｎｅ邋１：空白對(duì)照，以Ｈ２０為模板擴(kuò)增的輕鏈序列；Ｌａｎｅ邋２：空白對(duì)照，以Ｈ２０為模板擴(kuò)增的逡逑重鏈序列；Ｌａｎｅ３：陰性對(duì)照，以０ＨＳＶ２為模板擴(kuò)增的輕鏈序列；Ｌａｎｅ４：陰性對(duì)照，以ＯＨＳＶ２逡逑為模板擴(kuò)增的重鏈序列；Ｌａｎｅ５：以ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ為模板擴(kuò)增的輕鏈序列；Ｌａｎｅ６：以ＯＨＳＶ２－逡逑ａＰＤｌ為模板擴(kuò)增的重鏈序列。逡逑４７逡逑

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本文編號(hào)：2782386