【摘要】：研究背景免疫檢查點阻滯劑的應(yīng)用是腫瘤治療領(lǐng)域的一大突破,它已在多種腫瘤類型中取得了令人振奮的臨床療效。目前,美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準6種靶向CTLA-4、PD-1或PD-L1的單克隆抗體用于12種臨床腫瘤指征。不幸的是,只有10-40%的腫瘤患者能從中獲益。PD-1/PD-L1阻滯療效不佳通常可歸因于腫瘤微環(huán)境內(nèi)浸潤淋巴細胞有限。溶瘤病毒代表另外一種新興的腫瘤免疫療法,它主要通過選擇性的裂解腫瘤細胞導(dǎo)致其發(fā)生免疫原性死亡,釋放大量的腫瘤相關(guān)抗原、病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式,從而促進抗原提呈,募集T細胞,使T細胞致敏。此外,溶瘤病毒引起的Ⅰ型干擾素反應(yīng),亦可產(chǎn)生趨化因子,募集周圍的T細胞�；诿庖邫z查點阻滯劑和溶瘤病毒治療不同的作用機制,我們探討了二者聯(lián)合使用的新策略及其是否可以產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)。方法我們首先利用分子克隆和同源重組技術(shù)構(gòu)建了表達抗人PD-1單克隆抗體的新型溶瘤性Ⅱ型單純皰疹病毒(oHSV2-aPD1)。應(yīng)用蛋白免疫印跡和共培養(yǎng)實驗,我們檢測了 oHSV2-aPD1病毒產(chǎn)生PD-1單抗的能力及表達的PD-1單抗的生物學(xué)功能。通過病毒感染實驗和CCK8細胞增殖實驗,我們比較了未經(jīng)抗體修飾的親代溶瘤病毒oHSV2和表達抗人PD-1單抗的子代病毒oHSV2-aPD1的感染能力及體外溶瘤活性。應(yīng)用B16R小鼠黑色素瘤模型,我們探討了 oHSV2-aPD1病毒的體內(nèi)抗腫瘤效果。此外,利用流式細胞術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),我們進一步探索了 oHSV2-aPD1病毒療法對腫瘤微環(huán)境和機體系統(tǒng)免疫狀態(tài)的影響。結(jié)果(1)我們成功構(gòu)建了表達抗人PD-1單克隆抗體的新型溶瘤性Ⅱ型單純皰疹病毒,oHSV2-aPD1。(2)通過感染真核細胞,oHSV2-aPD1病毒表達出了分子量大小正確的抗人PD-1單克隆抗體,該抗體能識別人源PD-1抗原并與之結(jié)合,活化T細胞,促進細胞因子IFN-y和IL-2的合成。(3)oHSV2-aPD1病毒同親代病毒oHSV2相比,溶瘤譜未發(fā)生改變,溶瘤活性亦未被削弱。(4)在小鼠B16R黑色素瘤模型中,oHSV2-aPD1病毒療法獲得了與聯(lián)合治療(局部應(yīng)用oHSV2病毒+系統(tǒng)應(yīng)用抗人PD-1單抗)相似的抗腫瘤效果,并且這種療效無論是在抑制腫瘤生長還是延長小鼠生存期方面,都優(yōu)于單獨治療(單獨oHSV2或抗人PD-1單抗治療)。(5)oHSV2-aPD1病毒治療激活了機體腫瘤微環(huán)境和外周免疫系統(tǒng)內(nèi)大量的免疫效應(yīng)細胞和分子,并且減少了免疫抑制性細胞的比例。(6)機體外周免疫狀態(tài)與腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫狀態(tài)相比,與腫瘤免疫治療療效有更好的相關(guān)性。結(jié)論我們的研究表明,oHSV2-aPD1病毒療法在臨床前動物腫瘤模型中展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性和持久的療效反應(yīng),提示表達免疫檢查點阻滯劑的溶瘤病毒在腫瘤臨床治療中具有很大潛力。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;R730.51
【圖文】：

逑大小為６２９３邋５？，大于空載質(zhì)粒？１１０５２（１３４．５邋（分子量為４４９９邋５？），所以挑選的１－７逡逑號和９－１２號克隆均可能為正確的ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒（圖３ａ），我們選擇逡逑１－４號克隆進行后續(xù)酶切鑒定。成功的順式連接質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ經(jīng)ＥｃｏＲ逡逑Ｉ和Ａｇｅ邋Ｉ內(nèi)切酶雙酶切為５５６５邋ｂｐ和７２８邋ｂｐ兩個片段；成功的反式連接質(zhì)粒逡逑ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ邋經(jīng)邋ＥｃｏＲ邋Ｉ邋和邋Ａｇｅ邋Ｉ邋雙酶切為邋５２０３邋ｂｐ邋和邋１０９０邋ｂｐ邋兩片段，所逡逑以１號和３號克隆可能為正確的順式連接ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒（圖３ｂ）。逡逑經(jīng)一代測序驗證，１號克隆序列正確且無堿基突變，我們將其作為陽性克隆進行擴逡逑增，獲得了邋ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ邋質(zhì)粒。逡逑接下來我們利用ＤＮＡｚｏｌ試劑提取了邋0ＨＳＶ２病毒基因組，然后利用磷酸鈣微逡逑沉淀轉(zhuǎn)染法，將0ＨＳＶ２病毒基因組和穿梭質(zhì)粒ＰＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ共同轉(zhuǎn)染進逡逑入病毒生產(chǎn)細胞。0ＨＳＶ２病毒在復(fù)制過程中，約有十萬分之一的概率與ｐＨＧ５２ｄ３４．５－逡逑ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒發(fā)生同源重組，從而使ＣＭＶ－ｅＧＦＰ表達序列替換掉ｏＨＳＶ２病毒基逡逑因組中ＩＣＰ３４．５基因表達序列

入病毒生產(chǎn)細胞。0ＨＳＶ２病毒在復(fù)制過程中，約有十萬分之一的概率與ｐＨＧ５２ｄ３４．５－逡逑ＣＭＶ－ｅＧＦＰ質(zhì)粒發(fā)生同源重組，從而使ＣＭＶ－ｅＧＦＰ表達序列替換掉ｏＨＳＶ２病毒基逡逑因組中ＩＣＰ３４．５基因表達序列，得到少量的ｏＨＳＶ２－ｅＧＦＰ（ＩＣＰ３４．５位）病毒（圖４）。逡逑通過在熒光顯微鏡下進行多輪的挑選純化，最終獲得無0ＨＳＶ２病毒混雜的ＯＨＳＶ２－逡逑ｅＧＦＰ邋（ＩＣＰ３４．５邋位）純病毒。逡逑ｆｍｍｍ邐ＨＩ逡逑■邐■逡逑圖３穿梭質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ的構(gòu)建逡逑（ａ）線性質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５與ＣＭＶ－ｅＧＦＰ片段連接產(chǎn)物的基因組分子量分析。Ｌａｎｅ邋Ｍ２：挑選逡逑的卜１２號克��；Ｎ：陰性質(zhì)控，環(huán)形質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５。（ｂ）線性質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５與ＣＭＶ－ｅＧＦＰ逡逑片段連接產(chǎn)物的酶切鑒定。Ｌａｎｅ邋１－４：挑選的１－４號克隆經(jīng)ＥｃｏＲ邋Ｉ和Ａｇｅ邋Ｉ雙酶切產(chǎn)物；Ｎ１、逡逑Ｎ２：邋ＥｃｏＲＩ單酶切載體質(zhì)粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５產(chǎn)物。Ｍ：邋ＤＮＡ分子量標準，從上到下電泳條帶分子逡逑量依次為邋１０、８、６、５、４、３、２、１、０．８、０．５邋和邋０．３邋ｋｂ。逡逑４４逡逑

逑（圖７），一代測序結(jié)果證明序列正確且無堿基突變。至此，我們成功構(gòu)建了邋0ＨＳＶ２－逡逑ａＰＤｌ病毒，圖８所示即為病毒構(gòu)建總體示意圖。逡逑Ｐｈａｓｅ邐－邐Ｉ：逡逑圖６同源重組成功的ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ病毒形成的噬毒斑（２０0ｘ）逡逑圖７邋ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ病毒抗體基因修飾序列的ＤＮＡ梯度分析逡逑Ｌａｎｅ邋１：空白對照，以Ｈ２０為模板擴增的輕鏈序列；Ｌａｎｅ邋２：空白對照，以Ｈ２０為模板擴增的逡逑重鏈序列；Ｌａｎｅ３：陰性對照，以０ＨＳＶ２為模板擴增的輕鏈序列；Ｌａｎｅ４：陰性對照，以ＯＨＳＶ２逡逑為模板擴增的重鏈序列；Ｌａｎｅ５：以ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ為模板擴增的輕鏈序列；Ｌａｎｅ６：以ＯＨＳＶ２－逡逑ａＰＤｌ為模板擴增的重鏈序列。逡逑４７逡逑

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