【摘要】：植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常會(huì)遭遇多種逆境脅迫,這些脅迫會(huì)抑制植物的代謝活動(dòng)和生長發(fā)育過程,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)䦟?dǎo)致植物死亡。隨著全球氣候變暖,高溫脅迫對(duì)植物的影響日益加劇。在高溫脅迫下,番茄體內(nèi)會(huì)積累過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),破壞番茄細(xì)胞膜系統(tǒng),影響光合作用等生理過程,進(jìn)而抑制植株的生理代謝,限制其生長發(fā)育。因此,研究番茄響應(yīng)高溫脅迫的機(jī)制和分子基礎(chǔ),對(duì)提高番茄高溫抗性具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。NAC轉(zhuǎn)錄因子作為植物所特有的、最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,在植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。番茄作為重要的蔬菜作物,共包含102個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子,其中絕大部分成員的功能未知。我們克隆了番茄中的一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子(SlNAC73),并探討了其在葉綠素代謝過程中的作用和高溫脅迫下的功能。主要的研究結(jié)果如下:(1)從番茄中克隆得到SlNAC73(Solyc07g066330.2),該基因全長為1482 bp,包含1029 bp的開放閱讀框,編碼342個(gè)氨基酸,分子量為38.83 kDa,等電點(diǎn)為9.75。(2)將SlNAC73-GFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá),通過激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)SlNAC73蛋白定位于細(xì)胞核。利用酵母雜交系統(tǒng),證明SlNAC73具有轉(zhuǎn)錄激活活性,并且轉(zhuǎn)錄激活區(qū)位于氨基酸序列的C端。(3)組織表達(dá)分析表明,SlNAC73在根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中均有表達(dá),其中表達(dá)量最高的器官是種子。脅迫處理顯示,SlNAC73受高溫、低溫和多種激素(ABA、MeJA、GA、ET)的誘導(dǎo)。啟動(dòng)子元件分析表明,基因上游含有HSE,LTR,ABRE等多種響應(yīng)元件。(4)構(gòu)建SlNAC73基因的真核表達(dá)載體,通過葉盤法轉(zhuǎn)化番茄,獲得番茄過表達(dá)和RNAi株系,并通過PCR和qRT-PCR鑒定、篩選得到陽性株系。(5)正常生長條件下,當(dāng)SlNAC73表達(dá)量上調(diào)到一定水平時(shí),番茄葉片會(huì)出現(xiàn)過早黃化現(xiàn)象;黃化葉片葉綠素含量降低,光合能力降低。RNAi株系的葉綠素含量和光合速率與野生型番茄無明顯差異。(6)高溫脅迫下,番茄光合能力降低,葉綠素含量減少,但轉(zhuǎn)基因株系與野生型沒有明顯差異。這說明SlNAC73可能不參與高溫脅迫下的植物光合作用過程和葉綠素代謝途徑。(7)高溫脅迫下,過表達(dá)SlNAC73株系中ROS積累量更多,細(xì)胞膜受損更嚴(yán)重,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累量較少;RNAi沉默株系則表現(xiàn)出相反的情況。這表明過表達(dá)SlNAC73降低了番茄的高溫抗性。綜上所述,SlNAC73作為一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄因子,可以降低番茄的高溫抗性,并且它可能通過參與葉綠素的代謝過程,影響番茄的光合能力。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2;S641.2
【圖文】：

番茄轉(zhuǎn)錄因子 SlNAC73 基因的克隆以及功能分析差異，此外 C 端還具有轉(zhuǎn)錄激活活性，能夠激活或抑制下游基因表達(dá)。（3）NAC 域的每個(gè)單體由多個(gè)螺旋環(huán)繞一個(gè)反向平行的 β-折疊構(gòu)成，它們通過鹽橋等作用形有功能的 NAC 蛋白二聚體，二聚體表面富含正電荷，可能與 DNA 的結(jié)合相關(guān)（Ert al., 2004）。

圖 1-2 NAC 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)脅迫示意圖（Puranik et al., 2012）Fig. 1-2 Schematic of NAC transcription factors in response to stress (Puranik et al., 2012)Shen 等人研究發(fā)現(xiàn)，OsNAC2 作為負(fù)調(diào)控因子，能夠降低水稻對(duì)鹽和干旱的抗并且在開花期間，干旱處理過表達(dá) OsNAC2 株系還會(huì)降低水稻的產(chǎn)量（Shen et al., 20實(shí)驗(yàn)證明，OsNAC2 可以直接結(jié)合植物非生物脅迫和 ABA 信號(hào)通路中的兩個(gè)標(biāo)志OsLEA3 和 OsSAPK1 的啟動(dòng)子上，從而調(diào)節(jié)它們的表達(dá)。而水稻中另一個(gè) NAC 轉(zhuǎn)子 SNAC3 則可增加水稻對(duì)高溫、干旱和氧化脅迫的抗性。高溫脅迫下，SNAC3 通活并提高活性氧清除酶相關(guān)基因的表達(dá)，降低 H2O2、MDA 和相對(duì)電解質(zhì)滲漏水平（et al., 2015）。在小麥中，過表達(dá) TaNAC67 能夠顯著增強(qiáng)植物對(duì)干旱、鹽和凍害的性，TaNAC67 促進(jìn)多個(gè)非生物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，并且能改善植物的一些生理（Mao et al., 2014）。在研究番茄時(shí)發(fā)現(xiàn)， SlNAM1 通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低化物含量，減輕細(xì)胞膜的氧化損傷程度，從而提高番茄的抗低溫能力（Li et al., 201而 JUB1 可以被干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并能夠激活下游基因 DELLA 和脅迫相關(guān)

圖 1-3 被子植物葉綠素合成的分子調(diào)控（吳自明等，2008）Fig. 1-3 Molecular regulation of chlorophyll synthesis in angiosperms (Wu et al., 2008)σ-氨基酮戊酸 ALA（Aminolevulinic Acid）的生物合成是葉綠素合成過程中的重成部分，起著主導(dǎo)作用，也是葉綠體合成途徑中的限速步驟。從谷氨酸到 ALA 需過三個(gè)酶促反應(yīng)（谷氨酰 tRNA 合成酶，谷氨酸 tRNA 還原酶，谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶中谷氨酰 tRNA 還原酶（glutamyl tRNAreductase，GluTR）是關(guān)鍵的酶，該酶由 HEM因編碼（吳自明等，2008；張修德等，2016）。GluTR 受原葉綠素酸脂和血紅素的調(diào)節(jié)。研究表明，黑暗條件下，葉綠素合成途徑只能進(jìn)行到原葉綠素酸脂，但是隨葉綠素酸脂的積累，ALA 的合成會(huì)受到抑制，隨著光照的增加，植物體內(nèi)的原葉酸脂降低，ALA 的合成隨著升高。血紅素能夠抑制 ALA 的生物合成，具體作用是素通過負(fù)反饋途徑調(diào)節(jié) GluTR 的活性。同時(shí)，F(xiàn)LU（fluorescent in blue light）蛋白以直接與 GluTR 相互作用，抑制 GluTR 的活性（王平榮等，2009）。在葉綠素合成

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2781584