發(fā)布時間：2020-08-02 16:34

【摘要】：胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPSs)是由微生物分泌并附著在細(xì)胞壁表面的多聚糖和蛋白質(zhì)等復(fù)合物,在保持細(xì)胞形態(tài)、胞外酶的分泌以及脅迫環(huán)境下的積極防御等方面起著重要作用。本文旨在探究不同濃度的NaCl脅迫下耐鹽性有差異的兩株木霉菌的胞外聚合物組成和功能并初步分析了其耐鹽機理。主要研究結(jié)果如下:1.依據(jù)ITS/TEF/RPB序列ACCC 32524和ACCC 32527菌株鑒定為非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)。不同鹽分對ACCC 32524和ACCC 32527生長抑制情況依次為Na_3PO_4NaClNaNO_3Na_2SO_4乳酸鈉。以葡萄糖為碳源,二者的EPSs主要成分均為多糖類物質(zhì)。在高鹽(0.6 mol/L NaCl)脅迫5天后,ACCC 32527可分泌大量的EPSs多糖,較對照提高了1.1倍,顯著高于ACCC 32524。2.ACCC 32524和ACCC 32527的EPSs中有2種不同分子量的多糖組分(EPSs-1和EPSs-2)。隨NaCl濃度增加,多糖分子量增大,EPSs-1相對含量降低,而EPSs-2相對含量提高,且EPSs-1組分中的葡萄糖含量降低,而半乳糖和甘露糖的含量則顯著上升。3.通過EPSs與NaCl溶液作用前后的紅外光譜圖比較發(fā)現(xiàn)EPSs對NaCl無吸附作用。NaCl脅迫處理后,ACCC 32524和ACCC 32527 EPSs多糖抗氧化活性呈相反的變化趨勢,即隨著NaCl脅迫濃度增高,ACCC 32524 EPSs多糖氧自由基和ABTS~+·清除能力下降,而ACCC 32527 EPSs多糖的氧自由基和ABTS~+·清除能力增強。4.分析了有無NaCl脅迫下ACCC 32524和ACCC 32527的差異轉(zhuǎn)錄組和代謝組,共獲得44,594條單基因和336個代謝產(chǎn)物。在NaCl(0.4和0.6 mol/L)脅迫下,共有31個糖類轉(zhuǎn)運蛋白、多糖合成酶(糖基轉(zhuǎn)移酶、多糖脫乙酰酶等)等相關(guān)基因發(fā)生上調(diào)表達。此外,篩選出ACCC32524中8個滲透調(diào)節(jié),7個抗氧化酶和6個細(xì)胞壁及胞外物質(zhì)(疏水蛋白)合成的相關(guān)基因;ACCC 32527中7個滲透調(diào)節(jié),13個抗氧化和4個細(xì)胞壁及胞外物質(zhì)(疏水蛋白)合成的相關(guān)基因,且在NaCl脅迫下多數(shù)為上調(diào)表達。與ACCC 32524相比,ACCC 32527在NaCl脅迫下,多糖合成的前體物質(zhì)葡萄糖-1-磷酸以及真菌滲透調(diào)節(jié)的關(guān)鍵物質(zhì)(如甘油、氨基酸及其衍生物等)積累量較高。5.以果糖、木糖、丙三醇、甘露醇或蔗糖為碳源時,ACCC 32524和ACCC 32527的EPSs主要成分為蛋白質(zhì),其次為多糖類物質(zhì)。不同碳源培養(yǎng)下,NaCl脅迫均能促進EPSs中多糖物質(zhì)的合成,其中以木糖最為明顯,含量較對照提高41%以上。以蔗糖為底物時,ACCC 32524和ACCC32527的EPSs多糖獲得最大自由基清除能力。不同碳源及NaCl脅迫對ACCC 32524 EPSs多糖組分種類無明顯影響,但可改變單糖間比例。本論文以非洲哈茨木霉ACCC 32524和ACCC 32527為研究對象,通過分析有無鹽脅迫下的EPSs組成、抗氧活性、轉(zhuǎn)錄組和代謝組的差異,初步確定了與EPSs合成相關(guān)的關(guān)鍵基因和代謝產(chǎn)物,為揭示真菌的抗鹽機制提供了重要數(shù)據(jù)并初步奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q935
【圖文】：

圖 1.1 完整菌絲 3-D 形態(tài)圖D topographical image of an entire hyphal branch (Gazze et al., 2013) EPSs 真菌主要包括大多數(shù)的擔(dān)子菌等大型真菌、絲狀真菌在生態(tài)環(huán)境中主要承擔(dān)分解者的角色，其 EPSs 與工究都有著密切的關(guān)系。本文將近年來文獻報道中在實驗見表 1.1。根據(jù) EPSs 的研究方向的不同，可將其來源分主要研究生物脅迫或非生物脅迫下 EPSs 的防御機制、是挖掘 EPSs 潛在的體外醫(yī)藥生物活性。

圖 1.2 影響 EPSs 特性的外界環(huán)境條件示意圖Fig. 1.2 Schematic of external environmental conditions affecting EPSs characteristics (Shi et al., 2017)養(yǎng)基組分室條件下，微生物合成 EPSs 對底物的選擇有一定的偏好性。通常，蔗糖是大多數(shù)Ss 的最佳碳源(Liang and Wang, 2015)，而真菌一般利用葡萄糖作為碳源(楊同香等, 2人員在對粉質(zhì)棒束菌（Isaria farinosa）(Wang et al., 2008)、出芽短梗霉（A. pullull., 2014)、里氏木霉（T. reesei）(陳鑫等, 2017)和蝙蝠蛾擬青霉（P. hepiali）(Wu et al., 發(fā)酵培養(yǎng)基進行單因素條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，蔗糖是利于 EPSs 合成和菌絲生長的最適碳不同菌株碳代謝相關(guān)的酶類及轉(zhuǎn)運能力差異相關(guān)。絲狀真菌發(fā)酵碳源種類的差異不Ss 的產(chǎn)量，還可直接導(dǎo)致 EPSs 結(jié)構(gòu)的變化。以蔗糖作為唯一碳源進行葡萄肉座菌EPSs 發(fā)酵，多糖的支鏈結(jié)構(gòu)要少于以果糖為碳源時合成的多糖 10%左右，而其它構(gòu)、糖苷鍵類型）基本相同（Silva et al., 2005）。另一方面，發(fā)酵液中碳源含量也會合成。如以蔗糖為碳源進行出芽短梗霉（A. Pullulans）EPSs 發(fā)酵時，濃度一般控制在 蔗糖濃度過低（小于 2.5%），因碳源的缺乏而無多糖合成；若濃度高于 12.5%時，抑制作用也不利于多糖的合成(王長海等, 1994)。對于氮源，則會優(yōu)先考慮酵母粉和

圖 1.3 EPSs 各組分分布情況Fig. 1.3 Different constituents and sub-constituents of EPSs 多糖根據(jù)胞間定位的不同，微生物可以合成 3 種不同類型的多糖: 1.類似糖原等物質(zhì)起儲存胞內(nèi)多糖；2.胞壁多糖，如幾丁質(zhì)和肽聚糖等；3.胞外多糖，包括與細(xì)胞相連的莢膜發(fā)酵液中多糖，是 EPSs 重要組成部分，含多羥基（2 個或以上）的醛類或酮類化合物(C)。目前，常采用檢測方法包括蒽酮-硫酸比色法、苯酚-硫酸比色法、氨基己糖比色測分光光度法，不同測定方法對測定結(jié)果影響較大，因此在測量過程中需結(jié)合各組分含、可靠性進行綜合考慮。多糖結(jié)構(gòu)分析常用的方法有酸水解法、過碘酸氧化、甲基化 降解、甲醇解和乙酰解等化學(xué)方法和紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振、氣相聯(lián)用等物理方法，多糖的立體結(jié)構(gòu)一般采用 2D-NMR 及 X 射線衍射法(Ruhmann )。在實驗室中，測定多糖分子量最簡單實用的方法是凝膠滲透色譜法（GPC），根據(jù)同分子量的多糖與洗脫保留時間（tR）成一定關(guān)系進行測定。表 1.2 為近年來對絲狀糖的結(jié)構(gòu)研究結(jié)果，其中以雜多糖居多和部分同多糖，多糖分子量有幾千到幾十萬不

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