【摘要】：Salinicola tamaricis F01是從山東省東營市黃河三角洲生長的檉柳葉片部分分離出來的一株細(xì)菌,具有較高二價錳元素抗性。本文通過qRT-PCR、RNA-seq、SEM、XRD、蛋白質(zhì)分離提取等技術(shù)建立了S.tamaricis F01二價錳抗性氧化機(jī)制模型,完善了植物內(nèi)生菌錳生物氧化機(jī)制理論。本課題首先通過對S.tamaricis F01全基因組測序結(jié)果分析,預(yù)測部分錳氧化相關(guān)基因,通過qRT-PCR技術(shù)檢測S.tamaricis F01培養(yǎng)8 h、16 h、24 h、32 h、40 h和48 h后過氧化氫-過氧化物酶等基因表達(dá)水平得知,錳結(jié)合脂蛋白、主要外膜蛋白、過氧化氫酶、細(xì)胞外金屬蛋白酶等基因與S.tamaricis F01錳生物氧化相關(guān),同時,根據(jù)qRT-PCR結(jié)果確定了轉(zhuǎn)錄組測序處理時間。在最小影響生長濃度的錳脅迫下,通過分析轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果揭示了S.tamaricis F01在二價錳脅迫條件下的早期基因表達(dá)模式。在二價錳元素脅迫下,編碼錳外排泵、三元三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白、銨轉(zhuǎn)運(yùn)體、I型分泌的C末端靶向結(jié)構(gòu)域蛋白和細(xì)菌鐵蛋白等基因表達(dá)量顯著上調(diào),說明S.tamaricis F01可能通過外排、隔離、氧化和釋放銨等物質(zhì)改變細(xì)菌內(nèi)外部環(huán)境,解除二價錳元素對于S.tamaricis F01的毒性。此外,離子轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原反應(yīng)、三羧酸循環(huán)、糖類、脂肪酸特別是氨基酸代謝過程有關(guān)基因表達(dá)發(fā)生明顯變化,說明S.tamaricis F01通過多種代謝途徑的改變來防御非特異性的二價錳元素?fù)p傷,或調(diào)整整個細(xì)菌的代謝水平來適應(yīng)外界的二價錳元素脅迫。在這個過程中,細(xì)菌通過向外排出銨鹽、羧酸鹽等物質(zhì)改變了細(xì)菌外部環(huán)境,為二價金屬錳生物氧化提供了前體物質(zhì),有利于二價錳元素的生物氧化。部分轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、分子伴侶和代謝途徑關(guān)鍵酶等被二價錳元素誘導(dǎo)表達(dá),說明S.tamaricis F01在二價錳脅迫下細(xì)菌的整體調(diào)控是復(fù)雜而精細(xì)的,有助于維持細(xì)菌內(nèi)錳穩(wěn)態(tài)。為了進(jìn)一步證實(shí)S.tamaricis F01的錳氧化分子機(jī)制,通過硫酸銨沉淀、透析、離子交換層析、凝膠過濾、超濾法和SDS-PAGE技術(shù)分離得到錳(Mn~(2+))處理S.tamaricis F01菌株培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì),通過錳氧化蛋白樣品液錳液孵育與LBB檢測法驗證條帶蛋白質(zhì)錳氧化功能,通過二級質(zhì)譜技術(shù)檢測聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)種類,確定在二價錳元素脅迫下后期主要發(fā)揮作用的有過氧化氫-過氧化物酶和鞭毛蛋白同源蛋白質(zhì)。對兩種過氧化氫-過氧化物酶進(jìn)行SWISS-MODEL同源建模,發(fā)現(xiàn)兩種過氧化氫-過氧化物酶可能是同源二聚體,配體分子是氧原子。并且努力運(yùn)用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達(dá)過氧化氫-過氧化物酶基因。運(yùn)用XRD、SEM技術(shù)檢測經(jīng)過不同培養(yǎng)基PYCM、PYCM HEPES、改良PYCM、改良PYCM HEPES、K、K HEPES、NaCl質(zhì)量體積比為5%的LB、NaCl質(zhì)量體積比為5%的LB HEPES培養(yǎng)S.tamaricis F01得到的錳氧化物沉淀,確定S.tamaricis F01主要將二價金屬錳轉(zhuǎn)化為MnCO_3,同時產(chǎn)生極少量的MnO_2、Mn_2O_3、Mn_3O_4和MnO。并且通過SEM觀測S.tamaricis F01形成錳氧化物形態(tài),大量小型球狀、桿狀、柱狀顆粒聚集聯(lián)結(jié)成較大球狀、桿狀或者柱狀物質(zhì)。本課題還進(jìn)一步研究了植物內(nèi)生菌S.tamaricis F01和耐鹽堿植物相互作用關(guān)系。S.tamaricis F01具有獨(dú)特的促生抗逆性質(zhì),能產(chǎn)生吲哚乙酸、嗜鐵素和ACC脫氨酶等促生抗逆物質(zhì),但是S.tamaricis F01對于鹽地堿蓬株高、根長和重量外部特征沒有顯著影響,而且無法通過菌液澆灌定殖在鹽地堿蓬根部聚集生成錳氧化物膜狀覆蓋物,這可能與S.tamaricis F01的宿主是檉柳而非鹽地堿蓬有關(guān),以致無法通過菌液澆灌定殖構(gòu)建S.tamaricis F01與鹽地堿蓬復(fù)合體應(yīng)用于環(huán)境治理,需要進(jìn)行S.tamaricis F01回接木本檉柳實(shí)驗。綜上,本課題揭示了植物內(nèi)生菌S.tamaricis F01錳抗性及錳氧化分子機(jī)制,為闡明微生物尤其是植物內(nèi)生菌錳生物氧化機(jī)制提供了參考數(shù)據(jù),并為植物內(nèi)生菌環(huán)境治理的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q935
【圖文】：

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文驗證錳氧化細(xì)菌與植物鹽地堿蓬是否普遍存在錳氧化物膜現(xiàn)象，深入研錳污染土壤或者鹽堿地中，種植與植物內(nèi)生菌共生的鹽地堿蓬，富集錳除鹽地堿蓬，處理植株可消除錳污染，應(yīng)用 S. tamaricis F01 等錳氧化植于環(huán)境治理。同時期望檉柳內(nèi)生菌 S. tamaricis F01 可與鹽地堿蓬共生，作用，更有利于植物內(nèi)生菌錳氧化作用的發(fā)揮，深入研究挖掘 S. tamari氧化富集的環(huán)境保護(hù)作用[27]。課題是在發(fā)現(xiàn)新種 S. tamaricis F01 的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究細(xì)菌的錳氧化入挖掘 S. tamaricis F01 錳氧化相關(guān)基因與蛋白質(zhì)，期望建立整體植物內(nèi)tamaricis F01 錳氧化機(jī)制模型，期望在錳元素化合物工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用相關(guān)白質(zhì)，建立植物內(nèi)生菌與植物的復(fù)合體應(yīng)用于環(huán)境治理生態(tài)保護(hù)中，發(fā)究的實(shí)際應(yīng)用價值。

Mn(Ⅱ)處理時間的確定mmol/L Mn(Ⅱ)的 NaCl 質(zhì)量體積2 h、40 h、48 h 后，分別提取 RN生物氧化相關(guān)的基因，設(shè)計引物況。測序處理條件，在 S. tamaricis F4 h 后，在 4℃冰上收集菌體，一 引物 PCR 擴(kuò)增，送鉑尚生物有maricis F01 菌株，并且無其他細(xì)的樣品分別命名為 O1、O2、O3M3，使用液氮速凍樣品，置于 公司，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒�，進(jìn)

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文物(random hexamers)合成 cDNA，然后在 DNA 聚合成另一條鏈 cDNA，末端修復(fù)，添加 A 尾，連接測 選擇片段長短，PCR 擴(kuò)增，AMPureXPbeads 純化 P使用 Qubit2.0 檢測核酸含量，稀釋至 1ng/μL，使用達(dá)標(biāo)后使用 qPCR 方法準(zhǔn)確定量，確保文庫有效濃度 pooling，進(jìn)行 HiSeq/MiSeq 測序[28-33]。

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本文編號：2779151