【摘要】：普魯蘭酶是一種淀粉脫支酶,它能夠專一的水解支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵形成直鏈淀粉。它可以與α-淀粉酶共同作用,完全地水解淀粉,因而在淀粉加工、啤酒釀造以及功能性藥物多糖的工業(yè)生產中具有重要的作用。菌株的胞外分泌能力是衡量工程菌株性能的重要指標,高效的分泌能力可以有效的降低生產成本;淀粉的糖化一般都是在60℃、pH 4.5-pH 6.0之間的條件下進行,而且一般糖化時間為48-60小時。因此,提高重組菌株的酸堿適應性、胞外分泌能力與熱穩(wěn)定性對于淀粉加工過程中降低生產成本和改進生產工藝具有重要意義。本論文以Alteromonas sp.Y-389普魯蘭酶(PulA)為研究對象,基于多序列比對與結構域分析,構建了5個結構域截斷突變體與4個定點突變體。研究了切除普魯蘭酶的不同結構域、構建不同點突變對其催化活性與酶學性質的影響,最終得到了酶學性質比較好的疊加突變體。主要的研究結果如下:(1)在Alteromonas sp.Y-389普魯蘭酶序列比對分析與結構域分析的基礎上,以重組天然酶質粒為模板(PulA+pET-28a),成功構建了1個N端、4個C端突變體菌株。除Puld4不具有普魯蘭酶的活性之外,其它4個截斷突變體均表現(xiàn)出普魯蘭酶活性,而且4個截斷突變體的胞外酶分泌效率隨著蛋白質分子量的減小而逐漸增強,胞外酶活性占總酶活性的比例分別為13.5%、18.2%、20.1%和30.8%,與PulA重組菌株沒有分泌能力相比有了很大的提高。酶學性質的分析表明,截斷突變體與PulA的最適pH都為pH 6.0左右,但是截斷突變體的作用pH范圍變得更窄。Puld1、Puld2和Puld3與天然普魯蘭酶的最適作用溫度為35℃,Puld5的最適作用溫度為45℃,比天然普魯蘭酶的提高了10℃,半衰期達到了25 h,為天然酶的2.5倍,但是結構域的切除造成的空間結構的變化導致截斷突變體與底物結合的能力降低了,隨之催化效率也降低了。(2)基于多序列比對以及氨基酸性質分析,選擇了保守區(qū)域及保守區(qū)域周圍幾個氨基酸作為突變位點,構建了4個定點突變體以及一個疊加突變體。突變體的酶學性質分析結果顯示,突變體G603D和F654Y的比活力比重組天然酶的降低了43.7%和8.9%,突變體H611Q和F751L的比活力比重組天然酶的分別升高了64%和30.2%,疊加突變體與截斷突變體Puld5相比,其胞外分泌能力提高了4%。除G603D突變體與PulA的最適作用溫度都為35℃之外,其它突變體的最適溫度都有所提高。除突變體G603D之外,其它普魯蘭酶突變體的熱穩(wěn)定性都有不同程度的提高,PulA的半衰期僅僅只有10 h左右,普魯蘭酶突變體F654Y、H611Q、F751L和Puld5/H611Q的半衰期分別為20 h、20 h、15 h和50 h,分別是天然普魯蘭酶的2倍、2倍、1.5倍和5倍,截斷突變體與點突變體的相互疊加使得熱穩(wěn)定性得到了很大的提高。動力學參數(shù)分析結果顯示,截斷突變體的K_(cat)/K_m為天然酶的1.17倍,彌補了只切除結構域造成的催化效率降低的缺點。本研究通過一系列的分子改造,探究了結構域切除以及定點突變對天然普魯蘭酶酶學性質的影響,得到了催化活性與酶學性質較為優(yōu)良的疊加突變體Puld5/H611Q,為普魯蘭酶的工業(yè)化生產奠定了良好的實驗基礎。
【學位授予單位】：自然資源部第一海洋研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q936
【圖文】：

1圖 1-1 支鏈淀粉(左)和直鏈淀粉(右)的結構Fig. 1-1 The structure of amylopectin (left) and amylose (right)淀粉在工業(yè)領域得到了非常廣泛的應用，它能夠通過發(fā)酵產生氨基酸、酶制劑和乳酸等多種化合物 (DiasFFetal.,1997;ChangLT,1998)，化工、制藥、紡織、日化等工業(yè)領域不可或缺。無論是淀粉發(fā)酵還是淀淀粉大分子的水解步驟都是必不可少的，目前，由于 α-1,4-糖苷鍵水解比較早，技術比較成熟，因此大量性能優(yōu)良的產品被開發(fā)出來。雖然淀1,6-糖苷鍵只占所有糖苷鍵的 6%左右，但是它的存在使得淀粉形成大結構，導致支鏈淀粉在淀粉原料中的比例達到了 70%-80%。因此，α-1水解酶能夠大大提高淀粉的利用率。但是，目前市面上支鏈淀粉水解酶而且大部分依賴于進口，價格比較昂貴。

圖 1-2 普魯蘭酶的作用機制Fig. 1-2 The hydrolysis mechanism of pullulanase.3 普魯蘭酶的產生菌株自從 1961 年普魯蘭酶在產氣氣桿菌(Aerobacteraerogenes)中被首次發(fā)現(xiàn)在許多微生物中發(fā)現(xiàn)了它的存在。如下表 1-1，分別為產 Ⅰ 型普魯nder, et al., 1961)和產 Ⅱ 型普魯蘭酶(Domań-Pytka et al., 2004)的菌株。

圖 1-3 來源于 Bacillus acidopullulyticus 的普魯蘭酶Fig. 1-3 Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus注：PDB ID：2WAN魯蘭酶的應用蘭酶的主要作是水解 α-1,6-糖苷鍵，在淀粉水解過程中能夠將使所有的淀粉結構都變?yōu)橹辨�。為了提高淀粉質原料的利用率水解完成 α-1,4-糖苷鍵之后，再配合普魯蘭酶的作用使之完全工業(yè)中，液化和糖化是最關鍵的兩個步驟，液化過程就是淀粉低，主要是淀粉酶的作用；糖化過程中可以加入普魯蘭酶，對于原料的利用率有很大的提高(Hii S L et al., 2012)。

【參考文獻】

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本文編號：2777689