【摘要】：普魯蘭酶是一種淀粉脫支酶,它能夠?qū)Ｒ坏乃庵ф湹矸鄣摩?1,6-糖苷鍵形成直鏈淀粉。它可以與α-淀粉酶共同作用,完全地水解淀粉,因而在淀粉加工、啤酒釀造以及功能性藥物多糖的工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的作用。菌株的胞外分泌能力是衡量工程菌株性能的重要指標(biāo),高效的分泌能力可以有效的降低生產(chǎn)成本;淀粉的糖化一般都是在60℃、pH 4.5-pH 6.0之間的條件下進(jìn)行,而且一般糖化時(shí)間為48-60小時(shí)。因此,提高重組菌株的酸堿適應(yīng)性、胞外分泌能力與熱穩(wěn)定性對(duì)于淀粉加工過(guò)程中降低生產(chǎn)成本和改進(jìn)生產(chǎn)工藝具有重要意義。本論文以Alteromonas sp.Y-389普魯蘭酶(PulA)為研究對(duì)象,基于多序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)域分析,構(gòu)建了5個(gè)結(jié)構(gòu)域截?cái)嗤蛔凅w與4個(gè)定點(diǎn)突變體。研究了切除普魯蘭酶的不同結(jié)構(gòu)域、構(gòu)建不同點(diǎn)突變對(duì)其催化活性與酶學(xué)性質(zhì)的影響,最終得到了酶學(xué)性質(zhì)比較好的疊加突變體。主要的研究結(jié)果如下:(1)在Alteromonas sp.Y-389普魯蘭酶序列比對(duì)分析與結(jié)構(gòu)域分析的基礎(chǔ)上,以重組天然酶質(zhì)粒為模板(PulA+pET-28a),成功構(gòu)建了1個(gè)N端、4個(gè)C端突變體菌株。除Puld4不具有普魯蘭酶的活性之外,其它4個(gè)截?cái)嗤蛔凅w均表現(xiàn)出普魯蘭酶活性,而且4個(gè)截?cái)嗤蛔凅w的胞外酶分泌效率隨著蛋白質(zhì)分子量的減小而逐漸增強(qiáng),胞外酶活性占總酶活性的比例分別為13.5%、18.2%、20.1%和30.8%,與PulA重組菌株沒(méi)有分泌能力相比有了很大的提高。酶學(xué)性質(zhì)的分析表明,截?cái)嗤蛔凅w與PulA的最適pH都為pH 6.0左右,但是截?cái)嗤蛔凅w的作用pH范圍變得更窄。Puld1、Puld2和Puld3與天然普魯蘭酶的最適作用溫度為35℃,Puld5的最適作用溫度為45℃,比天然普魯蘭酶的提高了10℃,半衰期達(dá)到了25 h,為天然酶的2.5倍,但是結(jié)構(gòu)域的切除造成的空間結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致截?cái)嗤蛔凅w與底物結(jié)合的能力降低了,隨之催化效率也降低了。(2)基于多序列比對(duì)以及氨基酸性質(zhì)分析,選擇了保守區(qū)域及保守區(qū)域周圍幾個(gè)氨基酸作為突變位點(diǎn),構(gòu)建了4個(gè)定點(diǎn)突變體以及一個(gè)疊加突變體。突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示,突變體G603D和F654Y的比活力比重組天然酶的降低了43.7%和8.9%,突變體H611Q和F751L的比活力比重組天然酶的分別升高了64%和30.2%,疊加突變體與截?cái)嗤蛔凅wPuld5相比,其胞外分泌能力提高了4%。除G603D突變體與PulA的最適作用溫度都為35℃之外,其它突變體的最適溫度都有所提高。除突變體G603D之外,其它普魯蘭酶突變體的熱穩(wěn)定性都有不同程度的提高,PulA的半衰期僅僅只有10 h左右,普魯蘭酶突變體F654Y、H611Q、F751L和Puld5/H611Q的半衰期分別為20 h、20 h、15 h和50 h,分別是天然普魯蘭酶的2倍、2倍、1.5倍和5倍,截?cái)嗤蛔凅w與點(diǎn)突變體的相互疊加使得熱穩(wěn)定性得到了很大的提高。動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果顯示,截?cái)嗤蛔凅w的K_(cat)/K_m為天然酶的1.17倍,彌補(bǔ)了只切除結(jié)構(gòu)域造成的催化效率降低的缺點(diǎn)。本研究通過(guò)一系列的分子改造,探究了結(jié)構(gòu)域切除以及定點(diǎn)突變對(duì)天然普魯蘭酶酶學(xué)性質(zhì)的影響,得到了催化活性與酶學(xué)性質(zhì)較為優(yōu)良的疊加突變體Puld5/H611Q,為普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：自然資源部第一海洋研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q936
【圖文】：

1圖 1-1 支鏈淀粉(左)和直鏈淀粉(右)的結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 The structure of amylopectin (left) and amylose (right)淀粉在工業(yè)領(lǐng)域得到了非常廣泛的應(yīng)用，它能夠通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸、酶制劑和乳酸等多種化合物 (DiasFFetal.,1997;ChangLT,1998)，化工、制藥、紡織、日化等工業(yè)領(lǐng)域不可或缺。無(wú)論是淀粉發(fā)酵還是淀淀粉大分子的水解步驟都是必不可少的，目前，由于 α-1,4-糖苷鍵水解比較早，技術(shù)比較成熟，因此大量性能優(yōu)良的產(chǎn)品被開(kāi)發(fā)出來(lái)。雖然淀1,6-糖苷鍵只占所有糖苷鍵的 6%左右，但是它的存在使得淀粉形成大結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致支鏈淀粉在淀粉原料中的比例達(dá)到了 70%-80%。因此，α-1水解酶能夠大大提高淀粉的利用率。但是，目前市面上支鏈淀粉水解酶而且大部分依賴于進(jìn)口，價(jià)格比較昂貴。

圖 1-2 普魯蘭酶的作用機(jī)制Fig. 1-2 The hydrolysis mechanism of pullulanase.3 普魯蘭酶的產(chǎn)生菌株自從 1961 年普魯蘭酶在產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacteraerogenes)中被首次發(fā)現(xiàn)在許多微生物中發(fā)現(xiàn)了它的存在。如下表 1-1，分別為產(chǎn) Ⅰ 型普魯nder, et al., 1961)和產(chǎn) Ⅱ 型普魯蘭酶(Domań-Pytka et al., 2004)的菌株。

圖 1-3 來(lái)源于 Bacillus acidopullulyticus 的普魯蘭酶Fig. 1-3 Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus注：PDB ID：2WAN魯蘭酶的應(yīng)用蘭酶的主要作是水解 α-1,6-糖苷鍵，在淀粉水解過(guò)程中能夠?qū)⑹顾械牡矸劢Y(jié)構(gòu)都變?yōu)橹辨�。為了提高淀粉質(zhì)原料的利用率水解完成 α-1,4-糖苷鍵之后，再配合普魯蘭酶的作用使之完全工業(yè)中，液化和糖化是最關(guān)鍵的兩個(gè)步驟，液化過(guò)程就是淀粉低，主要是淀粉酶的作用；糖化過(guò)程中可以加入普魯蘭酶，對(duì)于原料的利用率有很大的提高(Hii S L et al., 2012)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2777689