【摘要】：巨大芽孢桿菌(Bacillusmegateium),芽孢桿菌屬,為革蘭氏陽(yáng)性菌,形體細(xì)長(zhǎng),相比其他微生物比較大,菌落形態(tài)規(guī)則,呈圓形,表面圓潤(rùn)無(wú)褶皺,上有凸起。巨大芽孢桿菌因其具有營(yíng)養(yǎng)要求低等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已廣泛的被應(yīng)用于工業(yè)與學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域,包括微生物肥料、生物的防治、畜牧業(yè)、水體的凈化和蛋白表達(dá)上的研究與應(yīng)用。在巨大芽孢桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域,發(fā)酵生物量低、生產(chǎn)成本高一直是限制其大規(guī)模應(yīng)用的瓶頸。課題組前期在造紙黑液池中分離到的一株菌體形態(tài)小、發(fā)酵密度明顯提高數(shù)倍的巨大芽孢桿菌B.megaterium BM2,通過(guò)與其它標(biāo)準(zhǔn)巨大菌株進(jìn)行發(fā)酵比較,發(fā)現(xiàn)其菌體形態(tài)大小與所產(chǎn)芽孢的大小均比標(biāo)準(zhǔn)菌株小,因此猜測(cè)其具有較高的發(fā)酵密度與菌體的形態(tài)有關(guān)。該菌株的優(yōu)勢(shì)使其在異源表達(dá)和微生物菌劑方面具有巨大的應(yīng)用潛力。本論文針對(duì)形態(tài)學(xué)和芽孢形成相關(guān)基因進(jìn)行研究。首先對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序,通過(guò)基因組和比較基因組分析初步找出了BM2菌株中可能與形態(tài)有關(guān)的基因,包括特有的壁磷壁酸合成有關(guān)基因(1751、1752)和與脂磷壁酸合成相關(guān)基因(/tasa、ltasb、ltasB)以及棒狀結(jié)構(gòu)蛋白MreB。利用溫度敏感型敲除載體pKVM1構(gòu)建敲除載體,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行探索,確定了利用E.coli S17-1接合轉(zhuǎn)移,插入失活的原理進(jìn)行基因敲除的敲除體系。隨后對(duì)篩選出的形態(tài)相關(guān)基因1751、1752、ltasa、ltasb、ltasB和mreB進(jìn)行基因敲除,構(gòu)建了一系列與形態(tài)有關(guān)的單個(gè)(B.megaterium BM2/Δ1751、B.megaterium BM2/Δ1752、B.megaterium BM2/Δ/ltasa、B.megaterium BM2/Δltasb、B.megaterium BM2/AltasB、B.megaterium BM2/ΔmreB)或多個(gè)敲除突變體(B.megaterium BM2/Δ1751Δ1752、B.megaterium BM2/ΔltasBΔltasb),并通過(guò)生長(zhǎng)驗(yàn)證觀察其生理變化,利用電鏡技術(shù)觀察其形態(tài)變化,以確定這些基因?qū)w生長(zhǎng)、細(xì)胞壁形成及菌體形態(tài)的影響。通過(guò)對(duì)各個(gè)敲除菌株進(jìn)行生理生化和形態(tài)分析,我們發(fā)現(xiàn)基因1751、1752、ltasa、ltasd、ltasB的單個(gè)或者多個(gè)缺失會(huì)造成菌體生長(zhǎng)變慢,而mreB基因的缺失使得菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量提高。在細(xì)胞形態(tài)上,通過(guò)掃描電鏡可以看出上述基因的缺失在不同程度上影響了細(xì)胞大小和形狀,如磷壁酸合成相關(guān)基因的缺失會(huì)使得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞變大(ltas)或者變小(17511、1752),mreB基因的缺失使得芽孢的生成受到嚴(yán)重抑制,并且細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)方形或者球狀。另外,TEM和Western Blot實(shí)驗(yàn)均表明上述基因的丟失會(huì)引起細(xì)胞壁成分的改變,這也是引起生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生變化的可能原因之一。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了我們初步篩選出的與形態(tài)有關(guān)的基因?qū)w的生長(zhǎng)及細(xì)胞大小有一定的影響,并且有的基因與芽孢形成相關(guān)。最后通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析B.megaterium BM2在生長(zhǎng)周期中的基因表達(dá)水平變化。一方面在基因表達(dá)水平上驗(yàn)證了本論文中篩選出的形態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)量差異;另一方面為進(jìn)一步探索與細(xì)胞形態(tài)和芽孢形成相關(guān)的其它基因提供數(shù)據(jù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q93
【圖文】：

磷壁酸是指包括含有磷酸二酯連接的多元醇重復(fù)單元的多種細(xì)胞表面糖聚合物逡逑家族（Ｗａｒｄ，邋１９８１）。磷壁酸包括通過(guò)糖脂錨定在細(xì)菌膜中的脂磷壁酸（ＬＴＡ）和逡逑與肽聚糖共價(jià)連接的ＷＴＡ邋（Ｎｅｕｈａｕｓ邋ｅ／ｆｌ／．，邋２００３；邋Ｗａｒｄ，邋１９８１）（圖１－２）。所有相逡逑關(guān)的淲壁酸是富含磷酸鹽的聚合物的異質(zhì)類，其與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚逡逑糖共價(jià)連接。它們由磷酸二酯連接的多元醇的主鏈或通過(guò)連接單元與肽聚糖連接逡逑的糖部分組成。甘油和核糖醇是最常見(jiàn)的多元醇，通常被Ｄ－丙氨酸或各種糖殘逡逑基取代。逡逑５逡逑

在革蘭氏陽(yáng)性菌中，脂磷壁酸（ＬＴＡ）被定義為一種通過(guò)脂質(zhì)錨定與細(xì)胞膜逡逑外連接的含有高雙磷酸鹽和復(fù)雜的含糖基磷酸鹽聚合物。Ｗｅｂｂ邋ＡＪ首先提出了逡逑ＬＴＡ在單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌中的合成途徑（圖１－４）邋（Ｗｅｂｂ邋ｅ／以，２００９）。逡逑根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，脂磷壁酸被分為不同的類型。Ｉ型ＬＴＡ具有簡(jiǎn)單的不分支逡逑聚甘汕磷酸酯骨架結(jié)構(gòu)，而ＩＩ型到Ｖ型ＬＴＡ具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。Ｉ型聚甘油逡逑磷酸酯的產(chǎn)生與膜脂代謝密切相關(guān)，其合成勹革蘭氏陰性菌中滲透調(diào)節(jié)的周質(zhì)葡逡逑聚糖的產(chǎn)生具有驚人的相似性。ＬＴＡ在細(xì)菌生長(zhǎng)和生理過(guò)程中起著重要的作用，逡逑有助于細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)和毒力。另外，ＬＴＡ的本質(zhì)使其具有成為疫苗和新型抗菌素逡逑的潛力（Ｐｅｒｃｙ邋ｅＺ邋ａ／．，邋２０１４）。逡逑ＬＴＡ逡逑ＤＡＧ邋Ｇａ｜＾｜°ＰＤＡＧ邐ＤＡ0邋Ｚ逡逑ＯＵＴＳＩＤＥ邐（－邐３逡逑邐？￣￣Ｇａｌ＾ｌｃ－ＯＡＧ邐——－ｆ邋￣￣＿嚴(yán)邋ｆ邋ｆ逡逑邐９邐?￣Ｗｍ￣￣ｐＰ＾＾—ｍ邐逡逑？邐Ｌｍｏ２５５３邐Ｌｍｏ０６４４邐Ｌｍｏ０９２７逡逑？牛邋ＵＤＰ邋＾ＡＵＰＰ邐ＬａｆＣ邐ＬｔａＰ邐ＬｔａＳ逡逑Ｌｍｏ２５５５邋＾邐Ｌｍｏ２５５４邋＾逡逑ＬａｆＡｕ0Ｐ＾，ｃ邋＂＂ｕＤＰ＾ａ，邐ＣＹＴＯＰＬＡＳＭ逡逑？邋？逡逑

逡逑圖１－４單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌中ＬＴＡ合成途徑逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－４邋ＬＴＡ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ邋Ｌｉｓｔｅｒｉａ邋ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ逡逑１．５基因敲除體系逡逑基因敲除技術(shù)是一種８０年代新發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，其通過(guò)一定的逡逑途徑使特定的基因失活或者缺失，從而研宄特定基因的特性�；蚯贸趶V義上逡逑是指運(yùn)用ＤＮＡ同源重組的原理，利用最初設(shè)計(jì)好的同源片段替代目標(biāo)基因的片逡逑段，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ｅ？ａ／．，１９８９）。逡逑到目前為止，最普遍的是利用同源重組原理進(jìn)行基因編輯。Ｓｅｒｖａｎｔ等早在逡逑１９９９年利用ｐＲＮ５１０１在球狀芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)ｃ／ｙ基因的重組（Ｓｅｒｖａｎｔ扣ａ／．，１９９９）；逡逑Ｅｓｐｉｎａｓｓｅ等同樣利用ｐＲＮ５１０１質(zhì)粒構(gòu)建的載體在蘇云金芽孢桿菌中成功對(duì)逡逑和邋ｅｃ／Ｔ等基因進(jìn)行敲除（Ｅｓｐｉｎａｓｓｅｅｆａ／．，２００４，Ｅｓｐｉｎａｓｓｅｅｆａ／．，逡逑２００４）

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