【摘要】：阿魏酸酯酶(feruloyl esterase,FAE,EC 3.1.1.73)是羧酸酯酶的一個亞類,它能水解植物細胞壁中阿魏酸與多糖之間連接的酯鍵,使得木質纖維素原料變得疏松,從而將阿魏酸釋放出來。FAE在食品、飼料、醫(yī)藥、造紙、化妝品、生物合成等領域有廣泛的應用前景。目前,FAE的催化性能仍有較大提升空間,因此FAE的改造意義深遠。本文基于foldon可自發(fā)形成寡聚化結構的特性,通過末端融合短肽foldon對FAE進行改造,并對重組FAE活性、酶學性質、寡聚化結構進行探究。主要研究結果如下:(1)從Uniprot數(shù)據庫中篩選出FAE O42807,根據畢赤酵母密碼子偏好性表達將其氨基酸序列轉換成fae基因序列,化學合成fae、fae-foldon基因序列,并連接至質粒pPIC9K,構建表達載體pPIC9K-fae、pPIC9K-fae-foldon。將表達質粒電轉化至畢赤酵母GS115中,經PCR驗證表明,成功獲得基因工程菌GS1115/pPIC9K-fae、GS1115/pPIC9K-fae-foldon。(2)設計含有His標簽的引物,將其克隆至表達載體pPIC9K-fae及pPIC9K-fae-foldon,成功構建表達載體pPIC9K-His-fae、pPIC9K-His-fae-foldon,電轉化至畢赤酵母GS115中,誘導培養(yǎng)后,發(fā)酵液經Ni層析柱收集洗脫液,GS115/pPIC9K-His-fae洗脫液經SDS-PEGE分析顯示在40 kD處有單一蛋白條帶(命名為mon-FAE_2),GS115/pPIC9K-His-fae-foldon洗脫液經SDS-PEGE分析顯示有3條蛋白條帶,分別為45 kD處的蛋白條帶(命名為pro-olig-FAE_2)、110kD處的蛋白條帶(命名為tri-FAE_2)及240 kD處的蛋白條帶(命名為six-FAE_2),經測定mon-FAE_2的FAE發(fā)酵液的酶活力為251.09±7.61 U/L,比活力為0.36±0.011 U/mg;multi-FAE_2(mon-FAE_2、tri-FAE_2及six-FAE_2的混合物)的FAE酶活力為440.78±12.7 U/L,比活力為1.63±0.045 U/mg。(3)為了減少FAE寡聚化時的空間位阻作用,在fae和foldon基因之間插入一段大小為1.63 kD的linker序列,成功構建表達載體pPIC9K-His-fae-linker-foldon,電轉化至畢赤酵母GS115中,誘導表達后發(fā)酵液經Ni層析柱收集洗脫液,洗脫液經SDS-PAGE分析顯示也有3條蛋白條帶,分別為45 kD處蛋白條帶(命名為pro-olig-FAE_3)、110 kD處的蛋白條帶(命名為tri-FAE_3)及240 kD處蛋白條帶(命名為six-FAE_3),經測定six-FAE_3的FAE發(fā)酵液的酶活力為334.14±11.24 U/L,比活力為1.74±0.063 U/mg。(4)重組FAE理化性質為:三種結構的FAE最適反應溫度均為50℃,mon-FAE_2、multi-FAE_2及six-FAE_3在50℃的半衰期分別為99.6 min、129 min及222min。mon-FAE_2的最適反應pH為6.0,且在pH為6.0時穩(wěn)定性較好,multi-FAE_2及six-FAE_3的最適pH為5.0,且在pH為5.0時穩(wěn)定性較好。對于mon-FAE_2,Mn~(2+)、Mg~(2+)對其有促進作用,K~+、Ca~(2+)、Fe~(3+)及Cu~(2+)對其有一定的抑制作用,而Zn~(2+)對其有顯著的抑制作用,對于multi-FAE_2及six-FAE_3,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(3+)及Cu~(2+)對其有促進作用,K~+對其有一定的抑制作用。multi-FAE_2較mon-FAE_2的比活力提高3.53倍,K_m值減小77.36%,k_(cat)/K_m值提高7.57倍。six-FAE_3較mon-FAE_2的比活力提高3.83倍,K_m常數(shù)減小75.16%,k_(cat)/K_m提高8.67倍。(5)25℃時在透射電子顯微鏡下可觀察到multi-FAE_2及six-FAE_3形成了寡聚化結構的蛋白聚集體。動態(tài)光散射結果表明隨著溫度的升高mon-FAE_2的平均粒徑保持不變,tri-FAE_2及tri-FAE_3的隨著溫度的升高逐漸解聚,直至65℃,tri-FAE_2及tri-FAE_3平均粒徑大小與mon-FAE_2平均粒徑大小幾乎一致,說明其已解聚為單體。本論文的實驗結果為FAE分子水平的改造提供基礎理論研究,該改造酶的方法簡單高效,無需事先詳細了解酶的3D結構,有很好的應用前景。
【學位授予單位】：華僑大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q816
【圖文】：

基于所有已發(fā)表的真菌基因組的FAE新系統(tǒng)發(fā)育樹

FAE的催化機理[2]

（a）foldon結構的側視圖（b）天然foldon結構域中三個β-發(fā)夾的相[82]

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

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本文編號：2774988