【摘要】：轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平測(cè)量計(jì)算是基因功能研究的重要手段,而真核生物選擇性剪切的存在給準(zhǔn)確計(jì)算基因異構(gòu)體表達(dá)水平帶來(lái)了困難。近幾年誕生的第三代測(cè)序技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組研究的一種新的實(shí)驗(yàn)方法,其顯著特點(diǎn)是可以獲得超長(zhǎng)讀段,彌補(bǔ)了第二代測(cè)序技術(shù)中的讀段過(guò)短,異構(gòu)體檢測(cè)較為困難的缺點(diǎn)。PacBio公司針對(duì)轉(zhuǎn)錄組提出的ISO-seq測(cè)序技術(shù),給轉(zhuǎn)錄組研究尤其是檢測(cè)新型異構(gòu)體領(lǐng)域帶來(lái)了新機(jī)遇。但目前對(duì)于ISO-seq數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄組研究的應(yīng)用中極少有工作涉及異構(gòu)體表達(dá)水平的計(jì)算,一部分研究工作通過(guò)結(jié)合RNA-seq技術(shù)數(shù)據(jù),使用ISO-seq與RNA-seq混合數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)水平的計(jì)算。而這些研究工作大多只用到小部分的全長(zhǎng)讀段數(shù)據(jù),丟失了大部分非全長(zhǎng)讀段數(shù)據(jù)中較多有用信息,因而數(shù)據(jù)沒有得到充分利用,造成數(shù)據(jù)通量低。另外,使用ISO-seq和RNA-seq混合數(shù)據(jù)的方法雖同時(shí)兼顧了兩種測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),但其計(jì)算復(fù)雜程度高,且獲取同一樣本下兩種測(cè)序技術(shù)數(shù)據(jù)的成本高。本文針對(duì)這些問(wèn)題,在保留非全長(zhǎng)讀段的基礎(chǔ)上,提出了僅使用ISO-seq單一數(shù)據(jù)同時(shí)預(yù)測(cè)異構(gòu)體結(jié)構(gòu)和計(jì)算其表達(dá)比例的兩個(gè)模型DSIDP和MCIDP。具體完成的工作如下:1)鑒于現(xiàn)有的預(yù)處理框架并不能滿足本文保留非全長(zhǎng)讀段的需求,本文首先提出了一套保留全長(zhǎng)和非全長(zhǎng)讀段的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法。從ISO-seq原始數(shù)據(jù)出發(fā),經(jīng)過(guò)下機(jī)數(shù)據(jù)處理、讀段糾錯(cuò)、讀段比對(duì)和外顯子序列整理四個(gè)步驟,最終獲得模型的輸入數(shù)據(jù)。2)針對(duì)具有全長(zhǎng)讀段的異構(gòu)體表達(dá)水平計(jì)算問(wèn)題,提出了DSIDP模型,從全長(zhǎng)讀段中建立異構(gòu)體預(yù)測(cè)集,同時(shí)采用全長(zhǎng)讀段和非全長(zhǎng)讀段計(jì)算異構(gòu)體表達(dá)比例。DSIDP將所有讀段比對(duì)至異構(gòu)體預(yù)測(cè)集,并使用Dirichlet采樣解決多源映射問(wèn)題。模型在模擬數(shù)據(jù)和真實(shí)數(shù)據(jù)上得到了有效驗(yàn)證。3)針對(duì)沒有全長(zhǎng)讀段的超長(zhǎng)異構(gòu)體檢測(cè)問(wèn)題,提出了MCIDP模型,采用馬爾科夫鏈模擬基因外顯子之間的選擇性剪接,該模型除了從全長(zhǎng)讀段中建立異構(gòu)體預(yù)測(cè)集外,還能預(yù)測(cè)出數(shù)據(jù)中沒有全長(zhǎng)讀段的超長(zhǎng)異構(gòu)體,這對(duì)新型異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。模型在模擬數(shù)據(jù)和真實(shí)數(shù)據(jù)上得到了有效驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：南京航空航天大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q811.4
【圖文】：

南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文基因中外顯子與內(nèi)含子。在經(jīng)過(guò)選擇性剪接事件之后，內(nèi)含子被剪去，外顯子之間拼接成兩個(gè)成熟的 mRNA，指導(dǎo)不同蛋白質(zhì)的合成。一條 mRNA 指導(dǎo)翻譯出一個(gè)蛋白質(zhì)，基轉(zhuǎn)錄出的 mRNA 數(shù)量越多，該基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)越多。因此通常使用某一基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 數(shù)量來(lái)量化該基因的表達(dá)情況，這一量化指標(biāo)被稱為基因表達(dá)水平。圖 2.2 展示過(guò)程中一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄生成出了兩個(gè)不同的 mRNA 分子，這樣的現(xiàn)象被稱為選擇性剪接，有極為重要的意義，具體描述將在后續(xù)章節(jié)給出。圖 2. 1 遺傳信息傳遞方式一

圖 2. 4 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序模式[31]圖 2. 5 環(huán)形一致測(cè)序模式[31]對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，PacBio 公司基于其單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)提出了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)eq 技術(shù)，對(duì) RNA 分子不做任何打斷處理直接逆轉(zhuǎn)錄出 cDNA 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利用上可超長(zhǎng)測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，能夠獲取到完整異構(gòu)體的堿基序列，為后續(xù)選擇性剪接、等位達(dá)、同源異構(gòu)體的研究提供精確數(shù)據(jù)保障。圖 2.6 展示了 ISO-seq 技術(shù)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程提取樣本中所有RNA提取PolyA尾的mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA序列

圖 2. 5 環(huán)形一致測(cè)序模式[31]對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，PacBio 公司基于其單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)提出了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)seq 技術(shù)，對(duì) RNA 分子不做任何打斷處理直接逆轉(zhuǎn)錄出 cDNA 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利用上可超長(zhǎng)測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，能夠獲取到完整異構(gòu)體的堿基序列，為后續(xù)選擇性剪接、等位達(dá)、同源異構(gòu)體的研究提供精確數(shù)據(jù)保障。圖 2.6 展示了 ISO-seq 技術(shù)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程提取樣本中所有RNA提取PolyA尾的mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA序列size-selection獲取不同長(zhǎng)度范圍的cDNA序列構(gòu)建環(huán)狀I(lǐng)SO-seq測(cè)序文庫(kù)SMRT測(cè)序儀測(cè)序

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