【摘要】：海洋是生命的起源地,其中蘊(yùn)含著豐富的資源,積極開發(fā)海洋資源,大力發(fā)展藍(lán)色經(jīng)濟(jì),是推動(dòng)強(qiáng)國戰(zhàn)略的重要方面。海洋生物中含有大量可利用的海洋多糖,瓊膠是其中重要的組成成分之一,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。瓊膠降解菌可產(chǎn)生瓊膠酶,為實(shí)現(xiàn)瓊膠多糖的綠色、高效的生物降解提供了有力的工具,受到了廣泛關(guān)注。本文以瓊膠降解菌為主要研究對(duì)象,進(jìn)行一系列研究工作。首先,以分離瓊膠降解細(xì)菌為出發(fā)點(diǎn),采集威海及日照沿海樣品進(jìn)行海洋微生物的篩選分離,共得到14株潛在新物種和7株瓊膠降解菌。對(duì)其中的2株海洋新物種O448T和F02T及1株新型瓊膠降解菌RQJ05T進(jìn)行多相分類。經(jīng)鑒定,菌株0448T呈革蘭氏染色陰性、好氧性、無運(yùn)動(dòng)性,氧化酶和過氧化氫酶呈陽性,主要的呼吸醌是Q-10,主要的脂肪酸成為是C18:1ω7c,極性脂組成主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和磷脂酰甘油,結(jié)合生理生化特征及遺傳學(xué)特征分析,菌株0448T確定為紅桿菌科中的新屬新種,命名為沉積物大洋桿菌(Oceanibium sediminis gen.nov.,sp.nov.);菌株F02T細(xì)胞呈革蘭氏陰性、嚴(yán)格需氧菌,具有運(yùn)動(dòng)性和氧化酶與過氧化氫酶活性,主要的呼吸醌是Q-8,主要的脂肪酸成分是C18:11ω7c、C16:1ω7c、C15:o和C18:1ω9c,主要的極性脂組成有磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和一種未被鑒定的磷脂,結(jié)合生理生化特征及遺傳學(xué)特征分析,確定為－-變形菌綱中的新屬新種,命名為沉積物海棲桿菌(Maribactrumsediminisgen.nov.,sp.nov.);菌株RQJ05T革蘭氏染色陰性、好氧型細(xì)菌,有運(yùn)動(dòng)性,氧化酶呈陽性但過氧化氫酶呈陰性,主要的呼吸醌是Q-8,主要的脂肪酸成分是Summed Feature 3(C16:1ω71 and/or C16:1ω6c)、C16:0 和 Summed Feature 8(C18:1 ω7c and/or C18:1ω6c),極性脂種類主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂,結(jié)合生理生化特征及遺傳學(xué)特征分析,確定為交替單胞菌科中的新屬新種,命名為嗜瓊膠藻生菌(Algilactibacter agarilytica gen.nov.sp.nov.)。對(duì)瓊膠降解菌QM202T和RQJ05.T進(jìn)行基因組測序,對(duì)瓊膠酶基因進(jìn)行預(yù)測分析,共預(yù)測出28條潛在瓊膠酶基因,其中菌株QM202T中有4條,RQJ05T中有24條。對(duì)預(yù)測得到的所有瓊膠酶基因進(jìn)行外源表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶活檢測,結(jié)果顯示共有11個(gè)瓊膠酶具有瓊膠降解活性,其中菌株QM202T中有4個(gè),RQJ05T中有7個(gè)。然后用親和層析的方式成功純化出重組瓊膠酶QM202-1與RQJ05-21。最后對(duì)純化后的重組瓊膠酶的結(jié)構(gòu)與酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究,結(jié)果顯示,瓊膠酶QM202-1屬于GH50家族,最適反應(yīng)溫度為30-40℃,最適反應(yīng)pH為7.0,DTT能大幅度增加酶活,降解產(chǎn)物為新瓊四糖,比酶活為34.7U/mg。瓊膠酶RQJ05-21屬于GH16家族,最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH為8.0,Co2+、Fe2+、DTT能大幅度增加酶活,具有瓊膠降解能力的同時(shí)也有一定程度降解淀粉、卡拉膠、海藻酸鈉的能力,降解瓊膠時(shí)比酶活為66.5 U/mg且產(chǎn)物為新瓊四糖與新瓊六糖。本研究分離并得到多株瓊膠降解菌與多條瓊膠酶蛋白,為實(shí)現(xiàn)瓊膠多糖的綠色、高效的生物降解提供了有力的工具。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q93
【圖文】：

模式和產(chǎn)物的不同，將瓊膠酶分類為ａ－瓊膠酶（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１５８）和（３－瓊膠酶逡逑（Ｅ．Ｃ．３．２N８１），ａ－瓊膠酶可以將瓊膠中的ａ－１，３糖苷鍵斷裂，而ｐ－瓊膠酶可逡逑以識(shí)別瓊膠中的Ｐ－１，４糖苷鍵并使其斷裂，如圖１－２所示叩】。其中Ｐ－瓊膠酶及逡逑其作用形成的低聚糖吸引了相當(dāng)多的行業(yè)。在藻類、海水和海洋沉積物等海洋環(huán)逡逑境中有著豐富的瓊膠酶基因資源，將這些基因轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)宿主所產(chǎn)生的重組逡逑瓊膠酶在惡劣環(huán)境中的催化效率和穩(wěn)定性得到了提高，因此適用于大規(guī)模的工業(yè)逡逑生產(chǎn)。逡逑Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｏｒ邐，逡逑Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｂｙａ－ａｇａｒａｓｅ邐Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｐ－ａｇａｒａｓｅ逡逑Ａｇａｒｏｓｅ邐Ａｇａｒｏｓｅ逡逑ｉ邐ｉ逡逑Ｏ＾Ｋ＞＃邋ＣＭＫＭＸ＞＃邐（ＳＫＭＸＸＤ＾逡逑Ａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ邐Ｎｅｏａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ逡逑Ｃｌｅａｖａｇｅ邋ｓｉｔｅ邋Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｅｎｄ邐Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ邋ｓｕｇａｒ逡逑｜邋ａ－１，３－ｌｉｎｋａｇｅ邋0邋Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋ｅｎｄ邋Ｇａｌａｃｔｏｓｅ逡逑｜邐卩－１．４－ｌｉｎｋａｇｅ邐？邋Ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋ｅｎｄ邋（＾）邐ＡＨＧ逡逑圖１－２瓊膠酶的降解模式圖Ｍ逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ａｇａｒａｓｅ逡逑１．２．２瓊膠酶的分類逡逑目前

子多糖直接降解為低聚糖聚合物，然后逐漸降解；外切型瓊膠酶的底物結(jié)合裂縫逡逑相對(duì)較小，或者是是以桶狀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，只能作用于瓊膠多糖的尾端使其斷裂，逐逡逑步降解，產(chǎn)物較為單一［５３］�；谧饔媚Ｊ胶铜傊复呋瘷C(jī)制的分類描述如圖１－３逡逑所示。逡逑■苷水解酵逡逑作用方式邐o<化機(jī)制逡逑Ｉ邐邋ｆ邐？逡逑一邋Ｔ？邐Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｃ逡逑（＾ＧＨ５０＾）邐Ｉ邐Ｕ逡逑Ｔ邐｜內(nèi)切酶逡逑ｊ￣￣ｒ邐Ｔ邋；ｒ逡逑（＾７＾）逡逑圖１－３瓊膠酶所在家族的分類逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｃｌａｓｓｉｆｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＨ邋ｆａｍｉｌｉｅｓ邋ｏｆ邋ａｇａｒａｓｅｓ逡逑４逡逑

面沒有觀察到鞭毛，符合沒有運(yùn)動(dòng)性這一特性。菌株０４４８１＇在ＭＡ培養(yǎng)基上在逡逑３３邋°Ｃ培養(yǎng)２天后，平板上形成微凸、表面光滑、米黃色、直徑大約０．８邋ｍｍ左逡逑右的圓形菌落。菌落形態(tài)與菌體形態(tài)如圖３－１所示。該菌株除在本實(shí)驗(yàn)室保藏之逡逑夕卜，新鮮菌體送至ＭＣＣＣ與ＫＣＴＣ成功保藏，保藏編號(hào)分別為ＭＣＣＣ邋１Ｈ００２３３逡逑與邋ＫＣＴＣ邋６２０７６。逡逑ｉ逡逑ｉ邋ｍｄ哪逡逑１１邐ＮＩＨＨＮ）邋？邐．ＩＮＩ逡逑圖３－１菌株０４４８Ｔ的菌落和菌體形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｌｏｎｙ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｙｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋０４４８１逡逑２３逡逑

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本文編號(hào)：2759249