【摘要】：雙組分信號系統(tǒng)(two-component system,TCS)是細菌感知和響應環(huán)境的普遍機制,由組氨酸激酶(histidine kinase,HK)和應答調(diào)控蛋白(response regulator,RR)組成,它們能夠使機體根據(jù)環(huán)境條件的改變做出適當?shù)募毎磻�。嗜根考克氏�?Kocuria rhizophila)是一種抗生素活性測試的常用質(zhì)量控制菌株,但目前有關它的TCS研究尚不多見,僅在DC2201菌株中有報道。本文以嗜根考克氏菌為研究對象,綜合采用生物信息學、現(xiàn)代微生物分子生物學的研究方法和技術,研究嗜根考克氏菌的TCSs,具體過程和結果如下:1.通過生物信息學手段對8株序列已知的嗜根考克氏菌菌株的TCSs進行了數(shù)量、結構和功能的分析,研究結果顯示嗜根考克氏菌中共存在13種TCSs,且HKs和RRs都是模塊化蛋白質(zhì),參與外界壓力應答、細胞壁合成、酶活性、物質(zhì)代謝與運輸?shù)壬顒印?.利用酵母雙雜交系統(tǒng),分別以嗜根考克氏菌HK8700和RR8701為誘餌蛋白和獵物蛋白,構建真核表達載體pGBT9-HK8700和pGAD10-RR8701,通過PEG/LiAc方法先后將載體導入到酵母菌AH109,采用多重氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選,證實了HK8700和RR8701具有相互作用。3.采用PCR的方法特異性擴增嗜根考克氏菌基因hk8700*和rr8701,分別構建原核表達載體pET-29a(+)-HK8700*和pPGH-RR8701,通過添加IPTG誘導、親和層析柱分離獲得大量可溶性蛋白HK8700*和RR8701。純化的蛋白HK8700*先進行自磷酸化反應,隨后與RR8701蛋白混合發(fā)生磷酸轉移現(xiàn)象,通過甲基綠染色顯現(xiàn)丙烯酰胺上磷酸化蛋白,證實了HK8700-RR8701是一對TCS。4.以嗜根考克氏菌的TCS HK8700-RR8701中的應答調(diào)控蛋白基因rr8701為目的基因,以溫度敏感型質(zhì)粒pKC1139為載體,擴增獲得rr8701上下游片段和質(zhì)粒pIJ790上的氯霉素基因cat,通過融合PCR的方法獲得敲除盒UCD,從而構建rr8701基因敲除載體pKC1139-UCD。以上結果對揭示嗜根考克氏菌雙組分信號系統(tǒng)、進而構建該菌的TCS調(diào)控網(wǎng)絡提供依據(jù);構建的敲除載體pKC1139-UCD為探討HK8700-RR8701的功能、建立嗜根考克氏菌的遺傳轉化系統(tǒng)奠定了基礎,并可推動其在工業(yè)上的應用。
【學位授予單位】：江西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q93
【圖文】：

圖 1-1 RR 超家族的分類[61]Figure 1-1 Classification of the RR superfamily餅圖顯示了五個 RR 家族在所有分類 RR 中的百分比；子類的進一步分類顯示 RR 家族子類的百分比分布如下所示；研究最多的子類的代表成員的結構在了說明。: Pie chart presenting the percentage distribution of the five RR families among alurther classification in subclasses is presented in horizontal bars. The percentage d subclasses within the respective RR family is indicated below. Structures of repbers of the most studied subclasses are illustrated in ribbon diagrams.3 雙組分信號系統(tǒng)的分布基因組調(diào)查顯示 TCSs 存在于三大界：細菌、古細菌和真核生物。以被認為不存在 TCSs[50, 62]，但最近在已完成測序的無膽甾原體基因組多個 HKs 和 RRs（mistdb.com）。此外，約有 50％的古細菌含有 T泉古菌門、初古菌門和納古菌門中尚未發(fā)現(xiàn)。早期的基因組調(diào)查表在于后生動物和原生生物中[51]，但是通過 SMART 數(shù)據(jù)庫查詢到真液霉菌的 TCSs。

碩士學位論文細胞活力影響的分子機制仍不清楚，其 TCS 系統(tǒng)也不清楚。本文首先采用生物信息學方法分析嗜根考克氏菌 TCSs 的數(shù)量、結然后利用酵母雙雜交系統(tǒng)，體外磷酸化分析方法對嗜根考克氏菌中的芽 孢 桿 菌 中 調(diào) 控 細 胞 分 裂 和 保 持 膜 完 整 性 的 LiaS-LiaR 具HK8700-RR8701 系統(tǒng)進行驗證，同時構建了 rr8701 敲除載體，為下根考克氏菌中 HK8700-RR8701 系統(tǒng)的功能，進而構建嗜根考克氏菌通路提供實驗依據(jù)。1.4 技術路線實驗研究的方法與技術路線如下：

13圖 2-1 嗜根考克氏菌的組氨酸激酶和應答調(diào)控蛋白結構示意圖Figure 2-1 Structural schematic overview on the histidine kinases and the response regulators ofTCS in Kocuria rhizophila注：跨膜螺旋由 TMHMM Server 2.0 預測；保守結構域及其位置由 BLASTp 預測。Note: The putative transmembrane helices were predicted by TMHMM Server 2.0; the conserveddomains and their location are indicated as predicted by BLASTp.一個典型的 HK 包含一個可變傳感結構域和一個保守的發(fā)射結構域，傳感結構域在 PFAM 中稱為 HisKA 結構域，通常是化學配體，一般用于檢測特定的刺激；發(fā)射結構域在 PFAM 數(shù)據(jù)庫中稱為 HATPase_c 結構域，包含一個保守的組氨酸殘基，通過磷酸化將信號傳遞到其同源 RR[93, 94]。HATPase_c 結構域結合ATP 并催化 γ-磷�；鶑� ATP 轉移至位于 HisKA 結構域內(nèi)的組氨酸殘基。此外，HATPase_c 結構域中參與 ATP 結合（G1, F, G2）的幾個基序都是高度保守的。在多數(shù)情況下，諸如 sCache_3_2 等其他結構域位于 N-末端 HisKA 結構域和 C-末端 HATPase_c 結構域之間。

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