【摘要】：目的:結(jié)合鄰位誘導(dǎo)雜交技術(shù),DNA納米結(jié)構(gòu)和局域空間內(nèi)DNA級(jí)聯(lián)反應(yīng),發(fā)展一個(gè)操作簡(jiǎn)單、快速,靈敏度高,特異性好且能夠在復(fù)雜樣品中使用的通用型蛋白質(zhì)檢測(cè)方法,為生物分子檢測(cè)提供新的思路。方法:通過(guò)酶連接反應(yīng)合成環(huán)形DNA模板,利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)制備得到長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的DNA納米支架。將一對(duì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈(H1和H2)與納米支架通過(guò)自組裝,合成可響應(yīng)的DNA納米燈,將其作為信號(hào)探針。以兩個(gè)核酸適配體作為鄰位雜交探針,當(dāng)有目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時(shí),一對(duì)鄰位探針同時(shí)識(shí)別目標(biāo)分子,使探針兩端連接的DNA鏈相互鄰近并雜交,形成單鏈DNA。該DNA單鏈可以通過(guò)指點(diǎn)取代反應(yīng)將發(fā)夾H1打開(kāi),誘導(dǎo)H1和H2之間發(fā)生級(jí)聯(lián)雜交反應(yīng),產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過(guò)血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了DNA納米燈的穩(wěn)定性;通過(guò)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),與均相DNA級(jí)聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)速度和效率進(jìn)行了比較;通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)生的熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量。利用三種非目標(biāo)蛋白質(zhì)作為模型,驗(yàn)證了該分析方法的特異性;通過(guò)對(duì)血液樣品的檢測(cè),驗(yàn)證了該分析方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果:研究結(jié)果表明,與發(fā)夾探針相比,信號(hào)探針DNA納米燈有更好血清穩(wěn)定性。利用凝血酶作為目標(biāo)蛋白質(zhì)模型,本論文發(fā)展的檢測(cè)方法,能夠在溫育30 min后實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。與均相DNA級(jí)聯(lián)反應(yīng)相比,鄰位誘導(dǎo)局域空間內(nèi)DNA級(jí)聯(lián)反應(yīng)效率更高、速度更快,且有很好的靈敏度,線性范圍為0.1 nM-20 nM,檢測(cè)限為0.091 nM。同時(shí),添加回收率范圍是97.1%-103.0%,RSD范圍是2.28%-6.78%。說(shuō)明該方法能夠有很好的重復(fù)性和選擇性。實(shí)際血清樣品檢測(cè)相對(duì)偏差小于6.5%。說(shuō)明該分析方法有很好的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。結(jié)論:本文發(fā)展了一個(gè)選擇性好,靈敏度高的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法,該方法操作簡(jiǎn)單,無(wú)需分離,可以在溶液中一步完成,并能夠用于復(fù)雜生物樣品檢測(cè)。通過(guò)改變鄰位探針上的識(shí)別分子,該方法可以用于其它目標(biāo)蛋白質(zhì)檢測(cè),有很好的通用性,在生物分析和臨床檢測(cè)中有良好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q503
【圖文】：

NA 納米燈作為信號(hào)探針，當(dāng)有目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時(shí)，一對(duì) DNA 適配體親和探針2）特異性的結(jié)合同一目標(biāo)蛋白質(zhì)，導(dǎo)致親和性探針鄰位雜交，形成一條單鏈 D鏈 DNA 可以與 DNA 納米燈上發(fā)夾 H1 的指點(diǎn)反應(yīng)，將發(fā)夾 H1 打開(kāi)，并將環(huán)來(lái)。釋放的環(huán)部序列可以作為被激活的指點(diǎn)，與發(fā)夾 H2 雜交，將其打開(kāi)。同 H2 的環(huán)部被釋放出來(lái)，可以與下一個(gè) H1 雜交。如此類推，一個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì) DNA 納米燈上多個(gè) H1 和 H2 發(fā)生級(jí)聯(lián)雜交反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而達(dá)到信效果。與以前報(bào)道的無(wú)酶催化放大技術(shù)[55-57]以及鄰位雜交信號(hào)放大方法[58,59]相 納米燈將多個(gè)發(fā)夾限制在一個(gè)局域的空間內(nèi)，不僅提高了反應(yīng)速度和反應(yīng)效加了檢測(cè)的靈敏度。該蛋白質(zhì)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速，有很好的靈敏度和選擇凝血酶分子作為檢測(cè)模型，該方法檢測(cè)限達(dá)到 pM 水平。此外，該方法有很好，通過(guò)改換探針上相應(yīng)的識(shí)別分子，該方法可以用于多種目標(biāo)蛋白質(zhì)檢測(cè)。該簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，能夠用于復(fù)雜生物樣品檢測(cè)，在臨床檢測(cè)和生物分析中有很前景。

第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析NA 納米燈（DNL）表征先通過(guò)凝膠電泳對(duì) DNA 納米燈的制備進(jìn)行了表征（圖 2-1A）。在滾環(huán)擴(kuò)一條堿基數(shù)在 500-2500 之間的拖尾的 DNA 帶(條帶 2)，說(shuō)明制備得到長(zhǎng)架。將物質(zhì)的量相等的 DNA 納米支架與發(fā)夾 H1(條帶 3)和 H2(條帶 4)混合純化后，從圖中可以看出，生成一個(gè)分子量更大的拖尾的條帶 5，且反應(yīng)消失，說(shuō)明 H1，H2 結(jié)合在 DNA 納米支架上，成功制備得到 DNA 納米燈利用原子力顯微鏡進(jìn)一步對(duì) DNA 納米燈進(jìn)行了表征。從圖 2-1B 可知，樣納米結(jié)構(gòu)生成，直徑約為 360 ±200 nm，高度約為 2.5 nm，說(shuō)明雙鏈狀因?yàn)?H1 和 H2 各與 DNA 納米支架有 24 個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)，約為 8.16 nM DNA 納米燈大約含有 22 對(duì)發(fā)夾 H1/H2。

東南大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖2-2. (a) 發(fā)夾Cy5-H1標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b) 雙色DNA納米燈在激發(fā)波長(zhǎng)為649 nm 時(shí)的熒光掃描波譜；(c) 發(fā)夾Cy3-H2標(biāo)準(zhǔn)曲線；(d) 雙色DNA納米燈在激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm 時(shí)的熒光掃描波譜。數(shù)據(jù)誤差棒表示平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=3).值約為1:1。由于進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)，H1和H2以1:1進(jìn)行，因此，DNA納米燈上H1和H2等量組裝為其級(jí)聯(lián)反應(yīng)能夠順利進(jìn)行提供了基礎(chǔ)。2.2 DNA 納米燈（DNL）穩(wěn)定性分析圖2-3. DNA納米燈特穩(wěn)定性表征. (a) DNA納米燈熱穩(wěn)定性曲線. (b) 熱穩(wěn)定性曲線負(fù)一階導(dǎo)數(shù)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 曾穎;蔡瑋紅;;食品過(guò)敏原快速檢測(cè)技術(shù)方法研究進(jìn)展[J];包裝與食品機(jī)械;2015年03期

2 李晶;滕霞;劉傳銀;;電化學(xué)生物傳感器測(cè)定甲胎蛋白的研究進(jìn)展[J];化學(xué)研究與應(yīng)用;2015年01期

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本文編號(hào)：2758630