【摘要】：哺乳動物白細(xì)胞介素21(interleukin-21,IL-21)是一種含四?螺旋簇結(jié)構(gòu)的新型細(xì)胞因子,屬于共用受體?鏈家族成員,主要由活化的CD4~+T細(xì)胞以及自然殺傷T(natural killer T,NKT)細(xì)胞產(chǎn)生,且在Th17細(xì)胞以及濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell,Tfh)類群中高表達(dá)。IL-21作為一種多效性的細(xì)胞因子,能夠作用于不同的免疫細(xì)胞以及非免疫細(xì)胞,在固有和獲得性免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用。盡管哺乳動物IL-21的功能研究已較為透徹,但硬骨魚IL-21的免疫調(diào)節(jié)功能還知甚少,僅有虹鱒IL-21的部分功能被報(bào)道。本研究擬探究草魚IL-21的免疫學(xué)功能。為此,首先克隆獲得草魚IL-21(Grass carp IL-21,gcIL-21)的編碼序列(Coding sequence,CDS),共450 bp,編碼149個(gè)氨基酸。然后,構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)并結(jié)合變復(fù)性方法獲得重組草魚IL-21蛋白(Recombinant gcIL-21,rgcIL-21),再利用此蛋白制備草魚IL-21多克隆抗體并驗(yàn)證抗體特異性。之后,使用此抗體,以草魚頭腎白細(xì)胞(Head kidney leukocytes,HKLs)為模型,免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)基上清中草魚IL-21的蛋白表達(dá)量,結(jié)果表明熱失活的嗜水氣單胞菌能夠明顯促進(jìn)HKLs分泌草魚IL-21,提示草魚IL-21可能參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。隨后,rgcIL-21的生物學(xué)活性被驗(yàn)證,結(jié)果顯示rgcIL-21能夠上調(diào)HKLs中草魚IFN-γ和SCOC3的mRNA表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),rgcIL-21處理草魚HKLs后,能夠以時(shí)間和劑量依賴方式顯著刺激草魚IL-10的mRNA表達(dá),并促進(jìn)草魚IL-10的蛋白分泌,提示草魚IL-21可能通過誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生發(fā)揮免疫抑制作用。相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),MAPK信號通路中的MEK和JNK信號通路部分參與了rgcIL-21對草魚IL-10基因表達(dá)的調(diào)控,并且,rgcIL-21能夠上調(diào)STAT3的磷酸化水平,激活STAT3信號通路。與rgcIL-21對IL-10的調(diào)控作用一致的是,rgcIL-21能夠顯著下調(diào)熱失活的嗜水氣單胞菌刺激的HKLs中促炎因子TNF-?和IL-1?的mRNA表達(dá),進(jìn)一步提示了草魚IL-21的免疫抑制作用。與此同時(shí),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明腹腔注射rgcIL-21一天后能夠提高感染了嗜水氣單胞菌的草魚的存活率,并減輕致病菌感染引起的病理反應(yīng)。本研究首次鑒定了草魚IL-21的免疫學(xué)功能,特別揭示了它在細(xì)菌感染的炎癥過程中發(fā)揮的免疫抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q41
【圖文】：

第二章 草魚 IL-21 的分子克隆與生物信息學(xué)分析第二章 草魚 IL-21 的分子克隆與生物信息學(xué)分析驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動物、菌株和質(zhì)粒驗(yàn)動物：體重 0.5-1 公斤的健康草魚購買于成都通威水產(chǎn)公司。本論實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》（2017 年第三相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并獲得電子科技大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。驗(yàn)菌株：實(shí)驗(yàn)所用克隆菌株為大腸桿菌 JM109，由實(shí)驗(yàn)室凍存。驗(yàn)質(zhì)粒：實(shí)驗(yàn)所用克隆載體為 pGEM -T Easy，購買自 Promega 公司 為其質(zhì)粒圖譜。

圖 2-2 草魚 IL-21 基因的結(jié)構(gòu)圖譜灰色方框和白色方框分別代表外顯子的氨基酸編碼區(qū)和 UTR 非編碼區(qū)，黑條代表內(nèi)含子。由 DNAMAN 8.0 翻譯草魚 IL-21 編碼序列并導(dǎo)出結(jié)果，草魚 IL-21 的編碼列以及它所對應(yīng)的氨基酸序列如圖 2-3 所示，共 149 個(gè)氨基酸，預(yù)測其中包含一19 個(gè)氨基酸的信號肽序列，圖中方框內(nèi)標(biāo)注為其信號肽序列。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王衛(wèi)衛(wèi);吳謖琦;孫修勤;樊廷俊;;硬骨魚免疫系統(tǒng)的組成與免疫應(yīng)答機(jī)制研究進(jìn)展[J];海洋科學(xué)進(jìn)展;2010年02期

本文編號：2739449