【摘要】：高性能的脂肪酶在能源工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、精細(xì)化學(xué)品合成和食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。固定化技術(shù)可以有效解決游離酶的很多缺陷。傳統(tǒng)的固定化通常是在單種載體上使用單一固定化策略;同時(shí)大部分有載體的固定化酶中目標(biāo)蛋白的含量極低;且將固定化策略與載體形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起的研究報(bào)道也較少。為解決上述問題,本研究在對洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶分子進(jìn)行充分的分子結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,研究了離子交換和共價(jià)鍵合協(xié)同作用的固定化策略;將三聚氰胺-戊二醛超支化合物連接在磁性納米顆粒表面,極大地提高了目標(biāo)蛋白的載量;將氧化碳納米管插入磷酸鹽納米花的核心中,獲得了結(jié)構(gòu)得到增強(qiáng)的復(fù)合材料。將上述得到的固定化酶進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用研究,驗(yàn)證了其良好催化性能。主要研究內(nèi)容及結(jié)果摘要如下:1.以洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶為研究對象,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,根據(jù)BCL分子表面活性氨基酸的分布,結(jié)合固定化載體的特征,以提高載體上酶分子活性和載體上蛋白質(zhì)載量為目的,設(shè)計(jì)了三種固定化酶,分別為離子交換和共價(jià)鍵合聯(lián)合運(yùn)用的BCL-GEAMNP、修飾了三聚氰胺-戊二醛樹狀分子的定向固定化酶BCL-GTAMNP和氧化碳納米管增強(qiáng)的磷酸鹽-BCL復(fù)合納米花。2.以BCL-GEAMNP為研究對象,首先采用各種表征手段測定載體和固定化酶BCL-GEAMNP的各種性質(zhì),以確定載體合成和固定化的成功;之后對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化,在最佳條件下,固定化酶的轉(zhuǎn)酯酶活回收率為147.4%;所得的固定化酶BCL-GEAMNP用于合成生物柴油,以叔丁醇作為最佳反應(yīng)介質(zhì);對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后,在最適反應(yīng)條件下,生物柴油得率在9 h時(shí)達(dá)到90.2%,12 h達(dá)到96.8%;可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明BCL-GEAMNP的操作穩(wěn)定性和催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的效率優(yōu)于僅利用共價(jià)鍵合法合成的固定化酶BCL-GAMNP。3.通過各種表征手段研究各種固定化載體和固定化酶的性質(zhì),確定采用一步法合成的載體GTAMNP具有蛋白載量高和合成簡便的優(yōu)勢,同時(shí)載體合成,修飾和固定化的成功也得到確認(rèn);之后在經(jīng)優(yōu)化后的最佳的固定化條件下,固定化酶的酯化比酶活和酶活回收率分別為76675.6 U/g-protein和5815.1%;在最適固定化條件下合成的BCL-GTAMNP用于催化1-苯乙醇和乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng),經(jīng)反應(yīng)條件的單因素優(yōu)化和反應(yīng)介質(zhì)的篩選后,轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和ee_s值分別可達(dá)到45.8%和84.3%;而經(jīng)底物乙酸乙烯酯處理過的固定化酶BCL-GTAMNP,其催化的拆分反應(yīng)的ee_s值在20 min就能達(dá)到98.8%。4.以七種復(fù)合納米材料為研究對象,經(jīng)FSEM和FT-IR表征確定材料合成和固定化的成功;經(jīng)固定化后,所有添加了碳納米管的固定化酶酶活較高,這說明在固定化時(shí)采用吸附法得到的固定化酶活效果明顯優(yōu)于只采用結(jié)晶沉淀法制備的固定化酶,經(jīng)氧化碳納米管增強(qiáng)后,各固定化酶的酯化酶活得到提升。將所有的固定化酶用于拆分1-苯乙醇,反應(yīng)的ee_s值提高明顯。選擇拆分效果較好的四種固定化酶作為研究對象,經(jīng)優(yōu)化后,效果最好的Cu_3(PO_4)_2/CNT/BCL催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和ee_s值分別為49.6%和98.3%,且它們的可重用性均較好,說明鹽結(jié)晶沉淀和物理吸附結(jié)合的方法制備的固定化酶在非水相催化反應(yīng)中具有巨大優(yōu)勢。5.為進(jìn)一步對比不同的固定化酶在非水相催化反應(yīng)中的優(yōu)劣,將四種固定化酶BCL-GAMNP、BCL-GEAMNP、BCL-GTAMNP和Cu_3(PO_4)_2/CNT/BCL用于有機(jī)相中制備香料添加劑乙酸龍葵酯。經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn),它們的酯化酶活分別較游離酶的提升明顯;經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化,其中BCL-GTAMNP催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可以在20 min內(nèi)達(dá)到99.9%;Cu_3(PO_4)_2/CNT/BCL的可以在10 min內(nèi)達(dá)到99.2%;對固定化酶進(jìn)行可重用性實(shí)驗(yàn),反應(yīng)重復(fù)8個(gè)批次后,轉(zhuǎn)化率幾乎未發(fā)生改變,BCL-GTAMNP和Cu_3(PO_4)_2/CNT/BCL的效果最佳。說明固定化脂肪酶也可用于乙酸龍葵酯的合成,且相對化學(xué)法具有一定的優(yōu)勢。綜上,本研究在對脂肪酶分子進(jìn)行充分分子結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,利用三種新的固定化策略,分別得到三種新式固定化脂肪酶,它們結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、酶活高、耐受性好,且分別在合成生物柴油、拆分手性底物和合成乙酸龍葵酯方面取得了良好的效果,具有很大的工業(yè)應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q814.2
【圖文】：

β7 和 αE 以及 β8 和 αF 之間[2, 3]。典型 α/β 水解酶二級結(jié)構(gòu)示意圖如下圖1.1 所示[4]。其它的 α/β 水解酶包括蛋白酶、鹵代烷脫鹵酶、乙酰膽堿酯酶、二烯內(nèi)酯水解酶和絲氨酸羧肽酶[2]。圖 1.1 典型的 α/β 水解酶折疊（箭頭表示β 折疊，矩形表示 α 螺旋，實(shí)心圓表示活性中心的氨基酸殘基）[4]Fig.1.1 Canonical α/β hydrolase fold where α-helices are represented by rectangles, and β-strands areindicated by arrows. The active site residues are shown as solid circles[4].不同脂肪酶的空間結(jié)構(gòu)在α螺旋和β折疊的數(shù)量和長度，α螺旋的空間位置分布，β 折疊的角度以及底物結(jié)合位點(diǎn)的具體空間結(jié)構(gòu)上有所差異[2, 3, 5]，但絕大多數(shù)脂肪酶都具有相似的空間結(jié)構(gòu)，包括催化三聯(lián)體，氧陰離子洞，“蓋子結(jié)構(gòu)”。少數(shù)脂肪酶沒有“蓋子”結(jié)構(gòu)，如脫葉鏈霉菌脂肪酶（Streptomyces exfoliatus lipase, SEL）、枯草芽

酶分子的界面激活過程有比較典型的一步激活，比如洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶（Burkholderia cepacia lipase, BCL）的變構(gòu)[8]；還有兩步激活，比如解脂耶氏酵母脂肪酶 Lip 2（Yarrowia lipolytica Lip 2，YLLIP2）[9]。具體的反應(yīng)過程如下圖 1.2所示。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2739406