【摘要】：α-L-鼠李糖苷酶特異性地切割天然產(chǎn)物末端的α-鼠李糖基,有效地提高了這些天然產(chǎn)物的生物活性和生物利用度。本課題組通過(guò)基于保守基序的PCR和人糞便宏基因組高通量測(cè)序,獲得了具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78。該酶分子質(zhì)量為85.5kD,等電點(diǎn)為5.58。在克隆到載體pET-28a時(shí),α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78的N-末端攜帶(His)_6標(biāo)簽。本論文對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行系統(tǒng)的研究,為該酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù),對(duì)于挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶資源具有重要的意義和價(jià)值。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,HFM-Rha78的親水性氨基酸分布均勻,無(wú)明顯的疏水區(qū),且總親水性平均系數(shù)為㧟0.425,表現(xiàn)出親水性。N端的原始剪切位點(diǎn)分值為0.135,信號(hào)肽平均分值為0.205,綜合剪切位點(diǎn)分值為0.185,皆處于較低水平,說(shuō)明該酶缺乏信號(hào)肽。HFM-Rha78的2級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主,分別占33.43%和41.47%,其余為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和延伸鏈,分別占6.8%和18.31%。該酶的催化廣義酸和廣義堿均是谷氨酸,催化殘基高度保守。以對(duì)硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR)為底物,紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定HFM-Rha78的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,最適反應(yīng)條件為:磷酸緩沖液pH 6.5,反應(yīng)溫度50℃。該酶在46℃以下保溫30 min,不會(huì)影響其酶活性,說(shuō)明其具有一定的熱穩(wěn)定性。HFM-Rha78能普遍耐受低濃度(1%以下)的有機(jī)溶劑,且1%~5%的異丙醇和1%的β-巰基乙醇還能夠顯著提高其酶活性。酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明HFM-Rha78對(duì)pNPR的親和性較弱。采用高效液相色譜法,研究HFM-Rha78對(duì)黃酮苷類(lèi)化合物蘆丁、柚皮苷和橙皮苷的催化活性。結(jié)果表明,該酶均能專(zhuān)一性地將3種底物分別轉(zhuǎn)化為異槲皮素、櫻桃苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷,轉(zhuǎn)化效率為柚皮苷(29)蘆丁(29)橙皮苷。該酶水解蘆丁、柚皮苷和橙皮苷的最適溫度分別為39℃、45℃和42℃,最適pH為7.5、6.5和5.5~6.0。柚皮苷最適反應(yīng)時(shí)間最短,為2 h,蘆丁及橙皮苷的最適反應(yīng)時(shí)間為12 h。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述構(gòu)上，異槲皮素僅比蘆丁少 1 個(gè)鼠李糖，，其具有的抗氧化、抗炎、抗突變、抗病毒等其他藥理活性卻明顯高于蘆丁，具有更好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景[6]。異槲皮素比蘆丁易吸收，是治療心肌缺血、腦缺氧和缺血性疾病的抗血栓藥物的材料之一，作用效果較蘆丁更明顯：能通過(guò)阻礙晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products, AGEs)合成來(lái)調(diào)節(jié)血糖、控制糖尿病及其血管并發(fā)癥[18]；對(duì) 9 種人腫瘤細(xì)胞系的體外研究表明，異槲皮素對(duì)各種癌細(xì)胞系的抑制作用比槲皮素和蘆丁強(qiáng)，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、卵巢腺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞[19]。異槲皮素進(jìn)入人體小腸后脫去配體糖基[20]，其產(chǎn)物通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶減少體內(nèi)尿酸生成速度，降低了高尿酸血癥的發(fā)病率，減少由其引發(fā)的痛風(fēng)和慢性腎病的風(fēng)險(xiǎn)。水解蘆丁的另一個(gè)產(chǎn)物——L-鼠李糖是一種甜度為蔗糖 1/3 的可食用甲基戊糖[21]，有研究[22]證實(shí)，L-鼠李糖常作為甜味劑添加至面包、肉制品等食品中，也可作為合成強(qiáng)心藥物的中間體等，并具有明顯的抗癌作用。

圖 1.2 α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷Fig.1.2 Process of α-L-rhamnosidase hydrolyzed naringin1.2.3 橙皮苷及橙皮素-7-O-葡萄糖苷的應(yīng)用價(jià)值橙皮苷是一種存在于自然界中的二氫黃酮，經(jīng) α-L-鼠李糖苷酶水解生成鼠李糖和橙皮素-7-O-葡萄糖苷（圖 1.3）。橙皮苷在人體中的生物利用率也低于橙皮素-7-O-葡萄糖苷[26]。α-L-鼠李糖苷酶水解橙皮苷常用于減輕橙皮苷晶體造成的飲品渾濁[4]和提升葡萄酒的香氣風(fēng)味[5]。在 10%的乙醇溶液中，橙皮素-7-O-葡萄糖苷的溶解度較橙皮苷提高了55倍[27]，在水中的溶解度是橙皮苷的50倍以上[26]，這使橙皮素-7-O-葡萄糖苷更易被利用至藥物制劑中，也更易被人體吸收。橙皮苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷都具有抑制人腸道麥芽糖酶和 HMG-CoA 還原酶作用，2 種作用方式中后者的影響明顯更大。治療Ⅱ型糖尿病所使用的降糖藥主要成分是糖苷酶抑制劑[28]，橙皮素-7-O-葡萄糖苷對(duì)人腸道麥芽糖酶的抑制作用比橙皮苷抑制作用強(qiáng) 1.7 倍[27]，可以作為有效的糖苷酶抑制劑控制餐后血糖峰值，延緩
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q55

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1 吳U嗚

本文編號(hào)：2710860