發(fā)布時(shí)間：2020-06-13 11:57

【摘要】：電荷異質(zhì)性是抗體的一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性,在抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中被極大重視。雖然許多引發(fā)電荷變體的體外化學(xué)機(jī)制較為清楚,但在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中由于涉及多重因素,特別是各種培養(yǎng)基組分以及它們之間的相互作用,造成電荷變體形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究來(lái)深入闡釋抗體電荷變體的形成原因及相關(guān)機(jī)制。前期在CHO(Chinese hamster overy,CHO)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),添加尿苷可大幅提高最大活細(xì)胞密度以及抗體的表達(dá)量。本研究在驗(yàn)證此結(jié)果的基礎(chǔ)上,首先分析了尿苷的添加對(duì)抗體電荷變體、糖基化、聚體、片段化、疏水性等質(zhì)量屬性的影響,研究發(fā)現(xiàn)尿苷的加入并未改善抗體堿性電荷變體含量極高的問(wèn)題。為此,進(jìn)一步考察了流加培養(yǎng)基中添加尿苷后生產(chǎn)的抗體中堿性電荷變體的組成,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在堿性電荷變體組成中雖然賴氨酸變體含量大幅減少,但抗體Fab(Fragment of antigen binding,Fab)區(qū)甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。通過(guò)過(guò)氧化氫和AAPH(2,2'-Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育實(shí)驗(yàn)證實(shí),甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗體堿性電荷變體形成的重要因素。隨后,通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加牛磺酸、檸檬酸鐵銨、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飛薊素和硫辛酸等抗氧化劑希望降低堿性電荷變體的含量,發(fā)現(xiàn)牛磺酸不僅使抗體堿性電荷變體的含量降低,并提高主峰的含量,而且還使最大活細(xì)胞密度略有提高,抗體產(chǎn)量顯著增加,同時(shí)添加�；撬釋�(duì)抗體的糖基化、聚體以及片段化等質(zhì)量屬性影響較小。進(jìn)一步研究表明,�；撬崾箍贵w堿性電荷變體減少的關(guān)鍵在于抗體的賴氨酸變體和氧化變體的減少,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和無(wú)細(xì)胞孵育實(shí)驗(yàn)顯示,�；撬峥赡芡ㄟ^(guò)促進(jìn)堿性羧肽酶的表達(dá)使賴氨酸變體減少。胞內(nèi)活性氧水平和培養(yǎng)液氧化還原電位的檢測(cè)結(jié)果顯示,�；撬峥赡苁峭ㄟ^(guò)抑制活性氧的形成以及提高培養(yǎng)液的還原性來(lái)減少氧化變體的生成。本研究結(jié)果為將來(lái)調(diào)控生產(chǎn)過(guò)程中抗體電荷異質(zhì)性的產(chǎn)生、提高抗體藥物的產(chǎn)量和質(zhì)量提供指導(dǎo)。
【圖文】：

１．４．２賴氨酸變體逡逑所有鼠及人ＩｇＧ重鏈終止于相同的由三個(gè)氨基酸組成的序列：脯氨酸－甘氨酸－賴氨逡逑酸。如圖１．３所示，通常將Ｃ末端賴氨酸不完全切除的情況稱為賴氨酸變體。賴氨酸的逡逑切除被認(rèn)為由堿性羧肽酶催化所致，羧肽酶是一種鋅結(jié)合酶，鋅是己知的羧肽酶的主要逡逑輔助因子之一，可以水解蛋白質(zhì)的單個(gè)Ｃ末端氨基酸ｔ％。因此，細(xì)胞培養(yǎng)基中鋅濃度的逡逑波動(dòng)會(huì)影響羧肽酶活性，導(dǎo)致Ｃ末端賴氨酸水平的變化％１。不同Ｃ末端賴氨酸的切除逡逑導(dǎo)致抗體混合物中蛋白的Ｃ末端含有０、１和２個(gè)賴氨酸殘基，由于賴氨酸帶正電，相逡逑對(duì)于主峰抗體，含一個(gè)或兩個(gè)賴氨酸殘基的抗體等電點(diǎn)更高，因此賴氨酸變體是一種堿逡逑性電荷變體。逡逑！邐＾＾－Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ邋ｉ00Ｈ邐ｊ逡逑ｊ邐（Ｌｙｓｊ邐！邋Ｐｒｏｌｉｎｅ邋ａｍｉｄａｔｉｏｎ邋！邋！逡逑■邐ｉＳｏｉ邋—＾邐逡逑１邐ｉ邋Ｌｙｓｉｎｅ邋ｃｌｉｐｐｉｎｇ邋ｊ邐／逡逑邐，逡逑圖１．３抗體重鏈Ｃ端修飾示意圖Ｗ邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ：堿性竣肽酶）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｔｈｅ邋Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ．邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ：邋Ｂａｓｉｃ邋ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）逡逑賴氨酸變體不會(huì)影響抗體功能，但其是否對(duì)藥物生物學(xué)活性有影響存在爭(zhēng)議。由于逡逑重鏈Ｃ末端位置離抗原抗體結(jié)合域及與Ｆｃ受體、補(bǔ)體等效應(yīng)分子相互作用的位點(diǎn)相對(duì)逡逑較遠(yuǎn)

３．３結(jié)果與討論逡逑３．３．１尿苷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)的影響逡逑圖３．１為兩組培養(yǎng)過(guò)程屮ｒＣＩ－ＩＯ細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞活率以及抗體產(chǎn)量的差異。如閣逡逑３．１邋ａ所示，整個(gè)培養(yǎng)周期為１２天，添加ＲSD的實(shí)驗(yàn)組最大活細(xì)胞密度相較于對(duì)照組打逡逑較大提高，對(duì)照組在培養(yǎng)第７天達(dá)到最火活細(xì)胞密度，力１０．０ｘ１邋0６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，實(shí)驗(yàn)組eA火逡逑活細(xì)胞密度則在第８天達(dá)到１５．４ｘｌ0６ｃｅｎｓ／ｍｌ。此外，，培養(yǎng)坫中以SD的添加還有利于培養(yǎng)逡逑后期細(xì)胞活率的維持。就對(duì)照組而Ｖｆ，「丨第７人細(xì)胞達(dá)到最大活細(xì)胞密度起，此后便進(jìn)逡逑入衰亡期，最大活細(xì)胞密度下降，從培養(yǎng)第１０天起細(xì)胞活率跌至９０％以下。而對(duì)了－實(shí)逡逑驗(yàn)組，尿苷的添加不僅大幅提高了最大活細(xì)胞密度，而且還減緩了培養(yǎng)后期細(xì)胞的衰亡，逡逑很好地維持細(xì)胞活率，在第１２天培養(yǎng)結(jié)g?時(shí)
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q813.11

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