發(fā)布時間：2020-06-13 11:57

【摘要】：電荷異質(zhì)性是抗體的一個關(guān)鍵質(zhì)量屬性,在抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程中被極大重視。雖然許多引發(fā)電荷變體的體外化學機制較為清楚,但在細胞培養(yǎng)過程中由于涉及多重因素,特別是各種培養(yǎng)基組分以及它們之間的相互作用,造成電荷變體形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究來深入闡釋抗體電荷變體的形成原因及相關(guān)機制。前期在CHO(Chinese hamster overy,CHO)細胞無血清培養(yǎng)基開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn),添加尿苷可大幅提高最大活細胞密度以及抗體的表達量。本研究在驗證此結(jié)果的基礎上,首先分析了尿苷的添加對抗體電荷變體、糖基化、聚體、片段化、疏水性等質(zhì)量屬性的影響,研究發(fā)現(xiàn)尿苷的加入并未改善抗體堿性電荷變體含量極高的問題。為此,進一步考察了流加培養(yǎng)基中添加尿苷后生產(chǎn)的抗體中堿性電荷變體的組成,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在堿性電荷變體組成中雖然賴氨酸變體含量大幅減少,但抗體Fab(Fragment of antigen binding,Fab)區(qū)甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。通過過氧化氫和AAPH(2,2'-Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育實驗證實,甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗體堿性電荷變體形成的重要因素。隨后,通過在細胞培養(yǎng)基中添加牛磺酸、檸檬酸鐵銨、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飛薊素和硫辛酸等抗氧化劑希望降低堿性電荷變體的含量,發(fā)現(xiàn)牛磺酸不僅使抗體堿性電荷變體的含量降低,并提高主峰的含量,而且還使最大活細胞密度略有提高,抗體產(chǎn)量顯著增加,同時添加�；撬釋贵w的糖基化、聚體以及片段化等質(zhì)量屬性影響較小。進一步研究表明,牛磺酸使抗體堿性電荷變體減少的關(guān)鍵在于抗體的賴氨酸變體和氧化變體的減少,實時熒光定量PCR和無細胞孵育實驗顯示,�；撬峥赡芡ㄟ^促進堿性羧肽酶的表達使賴氨酸變體減少。胞內(nèi)活性氧水平和培養(yǎng)液氧化還原電位的檢測結(jié)果顯示,牛磺酸可能是通過抑制活性氧的形成以及提高培養(yǎng)液的還原性來減少氧化變體的生成。本研究結(jié)果為將來調(diào)控生產(chǎn)過程中抗體電荷異質(zhì)性的產(chǎn)生、提高抗體藥物的產(chǎn)量和質(zhì)量提供指導。
【圖文】：

１．４．２賴氨酸變體逡逑所有鼠及人ＩｇＧ重鏈終止于相同的由三個氨基酸組成的序列：脯氨酸－甘氨酸－賴氨逡逑酸。如圖１．３所示，通常將Ｃ末端賴氨酸不完全切除的情況稱為賴氨酸變體。賴氨酸的逡逑切除被認為由堿性羧肽酶催化所致，羧肽酶是一種鋅結(jié)合酶，鋅是己知的羧肽酶的主要逡逑輔助因子之一，可以水解蛋白質(zhì)的單個Ｃ末端氨基酸ｔ％。因此，細胞培養(yǎng)基中鋅濃度的逡逑波動會影響羧肽酶活性，導致Ｃ末端賴氨酸水平的變化％１。不同Ｃ末端賴氨酸的切除逡逑導致抗體混合物中蛋白的Ｃ末端含有０、１和２個賴氨酸殘基，由于賴氨酸帶正電，相逡逑對于主峰抗體，含一個或兩個賴氨酸殘基的抗體等電點更高，因此賴氨酸變體是一種堿逡逑性電荷變體。逡逑！邐＾＾－Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ邋ｉ00Ｈ邐ｊ逡逑ｊ邐（Ｌｙｓｊ邐！邋Ｐｒｏｌｉｎｅ邋ａｍｉｄａｔｉｏｎ邋！邋！逡逑■邐ｉＳｏｉ邋—＾邐逡逑１邐ｉ邋Ｌｙｓｉｎｅ邋ｃｌｉｐｐｉｎｇ邋ｊ邐／逡逑邐，逡逑圖１．３抗體重鏈Ｃ端修飾示意圖Ｗ邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ：堿性竣肽酶）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｔｈｅ邋Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ．邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ：邋Ｂａｓｉｃ邋ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）逡逑賴氨酸變體不會影響抗體功能，但其是否對藥物生物學活性有影響存在爭議。由于逡逑重鏈Ｃ末端位置離抗原抗體結(jié)合域及與Ｆｃ受體、補體等效應分子相互作用的位點相對逡逑較遠

３．３結(jié)果與討論逡逑３．３．１尿苷對細胞生長和抗體表達的影響逡逑圖３．１為兩組培養(yǎng)過程屮ｒＣＩ－ＩＯ細胞的生長、細胞活率以及抗體產(chǎn)量的差異。如閣逡逑３．１邋ａ所示，整個培養(yǎng)周期為１２天，添加ＲSD的實驗組最大活細胞密度相較于對照組打逡逑較大提高，對照組在培養(yǎng)第７天達到最火活細胞密度，力１０．０ｘ１邋0６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，實驗組eA火逡逑活細胞密度則在第８天達到１５．４ｘｌ0６ｃｅｎｓ／ｍｌ。此外，，培養(yǎng)坫中以SD的添加還有利于培養(yǎng)逡逑后期細胞活率的維持。就對照組而Ｖｆ，「丨第７人細胞達到最大活細胞密度起，此后便進逡逑入衰亡期，最大活細胞密度下降，從培養(yǎng)第１０天起細胞活率跌至９０％以下。而對了－實逡逑驗組，尿苷的添加不僅大幅提高了最大活細胞密度，而且還減緩了培養(yǎng)后期細胞的衰亡，逡逑很好地維持細胞活率，在第１２天培養(yǎng)結(jié)g?時
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q813.11

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本文編號：2711143