發(fā)布時間：2020-06-09 19:13

【摘要】：甘油單酯脂肪酶是一類專一性地作用于甘油單酯底物的水解酶,其獨特的催化特性使其在工業(yè)應(yīng)用中極具應(yīng)用價值。另外,甘油單酯脂肪酶在哺乳動物生理調(diào)節(jié)方面也起到了關(guān)鍵的作用。開展工業(yè)需求或參與生理代謝關(guān)鍵酶三維結(jié)構(gòu)的研究,有助于理解該類酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及豐富酶學(xué)理論,具有科學(xué)與實際應(yīng)用研究價值。本課題以海洋地衣芽孢桿菌的甘油單酯脂肪酶Geobacillus sp.12AMOR1(GMGL)為研究對象,研究了重組酶的制備、酶學(xué)性質(zhì)及三維結(jié)構(gòu)的解析,結(jié)合定點突變和分子動力學(xué)模擬等手段研究及闡述GMGL識別及水解底物的過程。主要研究內(nèi)容如下:(1)GMGL的制備和酶學(xué)性質(zhì)研究。利用全基因合成技術(shù)獲得了來源于海洋地衣芽孢桿菌的甘油單酯脂肪酶基因,構(gòu)建了GMGL原核表達載體并在大腸桿菌BL21(DE3)宿主中實現(xiàn)了高表達,利用金屬螯合親和層析方法對GMGL重組酶蛋白進行“一步法”的分離純化,SDS-PAGE電泳分析顯示目的蛋白條帶均一,純度大于90%。酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果顯示:GMGL的最適反應(yīng)溫度為60 ~oC,該酶在70 ~oC的T_(1/2)為60 min;最適反應(yīng)pH為8.0,在偏堿性的環(huán)境中較為穩(wěn)定。水解甘油單酯底物及酯化甘油與脂肪酸的實驗證實,GMGL為甘油單酯脂肪酶。(2)GMGL晶體結(jié)構(gòu)的解析。采用凝膠過濾層析獲得更高純度的GMGL蛋白,并優(yōu)化獲得酶蛋白可衍射的結(jié)晶條件:蛋白濃度為12 mg/mL、0.2 M Ammonium sulfate、0.1 M MES monohydrate(pH 6.6)、28%w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000、20 ~oC。通過分子置換的方法解析出分辨率2.19?的GMGL蛋白結(jié)構(gòu)(PDB ID:5XKS)。GMGL結(jié)構(gòu)屬于典型的α/β水解酶類,由9個α-helix和9個β-sheet構(gòu)成。GMGL的催化三聯(lián)體由Ser97、Asp196和His226組成,氧負離子洞由Phe29和Met98的主鏈-NH-基組成。(3)GMGL底物選擇性的研究。通過晶體學(xué)分析,選擇了催化口袋中可能影響鏈長選擇性的Leu142、Ile145和Ile170等位點,構(gòu)建了Leu142Ala、Ile145Ala和Ile170Phe突變體�？疾炝艘吧图巴蛔凅w作用于不同脂肪酸鏈長的對硝基苯酚酯底物的k_(cat)/K_m值,結(jié)果顯示:相對于野生型,Leu142Ala、Ile145Ala和Ile170Phe對于pNP-C6底物的選擇性分別有2.3、1.2和2.2倍的提高。(4)GMGL識別及水解底物的過程。分子動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)單甘酯酶的結(jié)構(gòu)中存在獨特的“孔洞結(jié)構(gòu)”,選擇孔洞附近的S32、S35、S147和E156氨基酸位點,共構(gòu)建了12個突變體(S32W/S32V/S32A、S35W/S35V/S35A、S147W/S147V/S147A、E156W/E156V/E156A),并利用硬脂酸單甘酯為水解底物檢測酶突變體的水解活力。結(jié)果顯示:相對于野生型,所有突變體均表現(xiàn)出不同程度的抑制現(xiàn)象,提示該“孔洞結(jié)構(gòu)”可能是參與水解產(chǎn)物甘油的釋放通道。綜合生化實驗數(shù)據(jù)及生物計算分析,進一步提出了GMGL通過酶的“誘導(dǎo)契合”識別及水解底物的過程。
【圖文】：

圖 1-1 甘油單酯脂肪酶介導(dǎo) 2-花生烯酸甘油酯信號傳導(dǎo)和花生四烯酸代謝[30, 3Fig.1-1 Monoglyceride lipase in 2-arachidonoyl glycerol signaling and arachidonic acmetabolism[30, 31]1.1.2 甘油單酯脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用由于甘油單酯脂肪酶特殊的底物選擇性，因此可應(yīng)用在合成高純度甘油單酯的中。甘油單酯（MG）是一種優(yōu)質(zhì)高效的乳化劑和表面活性劑，其完全無毒無害，品工業(yè)中應(yīng)用中沒有限制，在精細化工業(yè)中使用前景更為廣闊，全世界每年需求量10 萬噸。MG 按照結(jié)構(gòu)類型可以分為 α-MG 和 β-MG，按照聯(lián)結(jié)的脂肪酸類型可以飽和脂肪酸單酯和不飽和脂肪酸單酯，它們天然油脂中含量特別低，只能通過工業(yè)以適應(yīng)市場需求。MG 是一種多元醇型非離子表面活性劑，能夠起到乳化劑、穩(wěn)分散劑、消泡劑和抗淀粉老化劑的作用。1.1.2.1 甘油單酯作為乳化劑和穩(wěn)定劑的應(yīng)用

底抑制 MGL 的活力。進一步的研究表明 JZL184 抑制 MGL 是通過與催化絲氨酸形價結(jié)合物發(fā)揮抑制作用的，并且這種結(jié)合是一種非可逆結(jié)合，不受到水解作用的影響近，Louis 等[53]報道了一種有效抑制劑——O-六氟異丙基氨基甲酸酯（SR48968， 1-3）。通過其與 MGL 的共結(jié)晶結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然 SAR629 與 KML29 有著相同的離團和哌啶氨基甲酸酯官能團，但該化合物的特點在于哌啶環(huán)上的不同取代基，其占化通道的內(nèi)部。SAR629 是 rMGL 和 hMGL 的有效抑制劑，其 IC50分別為 3.8 nM9 nM[54]。Saario 等[55]發(fā)現(xiàn) N-花生四烯�；R來酰亞胺（NAM，圖 1-3）是一種結(jié)構(gòu)類似于性底物 2-AG 的衍生物，是該系列抑制劑中最有效的化合物，其 IC50為 140 nM。緊，，Matuszak 等[56]通過對各種烷基-苯基 N-取代基的進一步研究證實了這一發(fā)現(xiàn)。并現(xiàn) NAM 和其他 N-取代的馬來酰亞胺衍生物是不可逆的 MGL 抑制劑。質(zhì)譜和誘變表明，NAM 對 hMGL 的抑制是由花生四烯�；R來酰亞胺基團與 Cys201 和 Cys2生相互作用，使得半胱氨酸的巰基烷基化，從而使得酶喪失活力。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q55

【參考文獻】

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本文編號：2705122