【摘要】：磷是植物營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育所必須的大量元素,它幾乎參與了植物細(xì)胞的所有生理代謝過程。缺磷會使植物的生物產(chǎn)量嚴(yán)重減少。游離態(tài)無機(jī)磷(Pi)是植物可利用磷的有效形式,但在土壤中Pi的含量卻非常低(約為10μM),所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常施加磷肥來保證作物的產(chǎn)量。然而世界上用來制作磷肥的磷礦石卻是一種分布不均的不可再生資源,因此如何提高植物對磷的利用效率是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)迫切需要解決的問題,而在分子水平上闡明植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲藏Pi的機(jī)制是有效解決這個問題的基礎(chǔ)。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn),一種SPX-MFS家族蛋白VPT1是主要負(fù)責(zé)向植物液泡中積累Pi的轉(zhuǎn)運(yùn)體。VPT(SPX-MFS)家族在擬南芥中共有三個成員,分別是VPT1,VPT2和VPT3,它們?nèi)慷ㄎ辉谝号菽ど�。為了進(jìn)一步研究VPT家族蛋白的功能,我們通過雜交的方法構(gòu)建了不同的雙突變(vptl/vpt2,vpt1/vpt3,vpt2/vpt3)和三突變(vptl/vpt2/vpt3)。表型和磷含量分析結(jié)果顯示vptl/vpt2雙突變與vptl的單突變的生理特征是相似的,而vpt2/vpt3與野生型沒有明顯差異。vpt1/vpt3雙突變較vpt1單突變則表現(xiàn)出明顯的生理差異。vpt1/vpt3雙突變體植株的磷含量顯著的低于vpt1,并且通過基因回補(bǔ)實驗可以消除這種磷含量的差異。通過電生理的實驗我們發(fā)現(xiàn)vpt1/vpt3磷含量的降低是由液泡儲存磷的功能減弱造成的。葉肉細(xì)胞的膜片鉗數(shù)據(jù)顯示vpt1/vpt3液泡的磷電流要顯著的低于vpt1單突變體,而vpt2/vpt3液泡的磷電流與野生型相比并無顯著差異。這些數(shù)據(jù)說明葉肉細(xì)胞中VPT1蛋白是最主要的液泡磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,在VPT1缺失的情況下,VPT3才開始行使著向液泡中儲存磷的功能。另外,vpt1/vpt3植株的磷穩(wěn)態(tài)較vpt1受到了更加嚴(yán)重的破壞,vpt1/vpt3適應(yīng)環(huán)境中磷濃度變化的能力更低,更加難以適應(yīng)高磷或低磷的脅迫,vpt1/vpt2/vpt3與vpt1/vpt3表型是一致的。此外,vpt1/vpt3出現(xiàn)了明顯的敗育現(xiàn)象,它所結(jié)出的果莢很短,并且種子缺刻現(xiàn)象嚴(yán)重。電鏡掃描、化學(xué)核染色以及體外花粉萌發(fā)實驗表明vpt1/vpt3的雄蕊和雌蕊發(fā)育并未受到影響。通過磷含量測定,我們意外地發(fā)現(xiàn)vpt1/vpt3花組織器官的磷含量要顯著的高于對照植株,而這種現(xiàn)象在其他雙突變中并未發(fā)現(xiàn),因此推測其敗育可能是磷毒害造成的。我們用不同磷濃度的培養(yǎng)液對vpt1/vpt3進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),隨著磷濃度的升高其花組織的磷含量越高且敗育的現(xiàn)象也更加嚴(yán)重。當(dāng)磷濃度達(dá)到1.3 mM時,vpt1/vpt3已經(jīng)很難結(jié)出果莢,而磷濃度較低時(1.3μM)則能夠結(jié)出正常的果莢和種子。我們進(jìn)一步對花器官的不同部分(雌蕊,雄蕊,花瓣,萼片)的磷含量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)vpt1/vpt3花組織器官不同部位的磷含量都要高于對照植株。雜交試驗證明,磷含量高的雌蕊是產(chǎn)生敗育的原因。我們以野生型做父本,以不同磷濃度培養(yǎng)的vpt1/vpt3做母本進(jìn)行雜交,并運(yùn)用化學(xué)染色的方法觀察體內(nèi)花粉管伸長的情況。發(fā)現(xiàn)花粉管伸長隨著母本培養(yǎng)液磷濃度的升高而受到明顯抑制,并且體外的花粉管伸長實驗與體內(nèi)的結(jié)果一致。這說明磷毒害會嚴(yán)重影響花粉管的伸長并導(dǎo)致敗育。植物地上部的磷主要來源于根從環(huán)境中吸收的有效磷,這些磷通過植物體內(nèi)的維管系統(tǒng)進(jìn)行長距離運(yùn)輸,最終分配到不同的組織來行使其生理功能。因此,我們推測vpt1/vpt3花器官的磷含量較高是由其體內(nèi)長距離運(yùn)輸?shù)牧纵^多導(dǎo)致的。通過檢測木質(zhì)液中的磷含量,我們發(fā)現(xiàn)vpt1/vpt3木質(zhì)液中的磷含量要顯著高于對照植株。為了進(jìn)一步確認(rèn)實驗結(jié)果,我們通過遺傳學(xué)的方法制作了vpt1/vpt3/pho1 三基因缺失突變體,PHO1是參與磷在植物體內(nèi)長距離運(yùn)輸?shù)闹饕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白。表型分析結(jié)果顯示,PHO1的突變可以有效回補(bǔ)vpt1/vpt3敗育的表型。這也就說明vpt1/vpt3花器官中磷的過多積累是磷的長距離運(yùn)輸紊亂造成的。因此,VPT家族蛋白對磷在整個植株中的分配也起到關(guān)鍵調(diào)控作用,而這種磷穩(wěn)態(tài)在植物的生殖發(fā)育中有著舉足輕重的地位。砷酸根[As(V)]與磷酸根有著極為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),它可以通過磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入到植物體內(nèi),并對植物造成毒害。為了檢測VPT家族蛋白是否在植物響應(yīng)砷脅迫中起到關(guān)鍵作用,我們對vpt突變體進(jìn)行了砷處理。實驗結(jié)果顯示,vpt1對五價砷毒害有較強(qiáng)的耐受性,同時,與vptl相比vpt1/vpt3(和vpt1/vpt2/vpt3)有著更強(qiáng)的耐砷能力。于此相反,VPT1的過表達(dá)植株則表現(xiàn)出對砷毒害敏感的表型。并且,vpt1砷的積累顯著低于野生型,而VPT1過表達(dá)植株會加劇砷的積累。這些反向遺傳學(xué)的數(shù)據(jù)證明,VPT家族蛋白必然參與了植物響應(yīng)砷毒害的過程。我們以VPT1為對象做進(jìn)一步研究,通過酵母表達(dá)系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)VPT1并不能轉(zhuǎn)運(yùn)As(V)。這說明VPT1并非通過直接轉(zhuǎn)運(yùn)砷而參與到植物響應(yīng)砷毒害過程中的。前期的研究表明VPT1的缺失會導(dǎo)致磷不能轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡而積累在細(xì)胞質(zhì)中,因此細(xì)胞質(zhì)中過量積累的磷會反饋抑制細(xì)胞膜上主要的磷轉(zhuǎn)運(yùn)體PHT1家族基因。qPCR的數(shù)據(jù)顯示與野生型植株相比vpt1中大部分PHT1家族基因的表達(dá)都得到了下調(diào),而PHT1家族蛋白的砷轉(zhuǎn)運(yùn)功能是As(V)進(jìn)入植物體的主要途徑。因此,我們推測vpt1的耐砷能力是其細(xì)胞內(nèi)磷平衡紊亂所致。我們在低磷條件下再次對vptl進(jìn)行砷處理,發(fā)現(xiàn)其耐砷的表型消失了,因此vpt1的耐砷能力是依賴于磷濃度的并與PHT1基因密切相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)VPT1參與耐砷的分子機(jī)制,我們通過qPCR的方法檢測了 VPT1應(yīng)砷毒害的表達(dá)模式。實驗結(jié)果隨著砷處理時間的增長VPT1的表達(dá)沒有明顯變化的�？紤]到RNA轉(zhuǎn)錄水平的變化并不能完全反應(yīng)基因行使功能的變化,我們在蛋白水平上對VPT1進(jìn)行了檢測。將35S啟動的融合有綠色熒光蛋白的VPT1穩(wěn)定表達(dá)植株進(jìn)行砷處理,通過熒光顯微觀察我們發(fā)現(xiàn)液泡膜上的VPT1隨著處理時間的延長會越來越少,但是其定位的模式并未發(fā)生改變。砷處理80小時后,液泡上的VPT1較對照處理降低了約60%。因此,植物在遇到砷毒害時會降低VPT1基因的表達(dá)量和其蛋白的在液泡膜上的積累量,使得細(xì)胞質(zhì)中的磷水平提高,進(jìn)而反饋抑制細(xì)胞膜上PHT1家族成員的表達(dá),最終緩解砷的毒害。
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其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)膜上，可見ＰＴ８的磷酸化在磷吸收的過程中起負(fù)調(diào)控作用（Ｃｈｅｎ逡逑以0／．，２０１５）。另一研宄發(fā)現(xiàn)定位在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白ＡＬＩＸ也參與了邋ＰＨＴ１在細(xì)胞逡逑內(nèi)的運(yùn)輸（Ｃａｒｄｏｎａ－Ｌｏｐｅｚｅ／邋0／．，邋２０１５）。與邋ＰＨＦ１邋相反，ＡＬＩＸ邋并沒有將邋ＰＨＴ１邋運(yùn)逡逑送到細(xì)胞膜上去發(fā)揮功能，而是將ＰＨＴ１轉(zhuǎn)移到液泡中進(jìn)行降解。ＡＬＩＸ可以與逡逑ＥＳＣＲＴ－ｍ（ＥＮＤＯＳＯＭＡＬ邋ＣＯＭＰＬＥＸ邋ＲＥＱＵＩＲＥＤ邋ＦＯＲ邋ＴＲＡＮＳＰＯＲＴ－１１１）互作，逡逑ＥＳＣＲＴ－丨丨丨在內(nèi)吞小體（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）整合成為多泡體（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ邋ｂｏｄｙ，ＭＶＢ）逡逑過程中起到關(guān)鍵作用，多泡體最終將包含物釋放進(jìn)液泡進(jìn)行降解。在高磷環(huán)境中，逡逑ＰＨＴ１；丨可以脫離細(xì)胞膜而被分揀到多泡體中，進(jìn)而被釋放進(jìn)液泡里完成蛋白降逡逑解的生理過程。在這個運(yùn)輸?shù)倪^程中，ＡＬＩＸ和ＥＳＣＲ１－ＩＮ是必不可少的。在ａ／／ｘ逡逑基因缺失突變體中，磷的穩(wěn)態(tài)遭到了很大的破壞。這是由于本該降解的ＰＨＴ１；Ｉ逡逑沒有被運(yùn)到液泡，，使得過量的ＰＨＴ１；丨蛋白在細(xì)胞上枳累所導(dǎo)致的。由此可見，逡逑植物吸收磷的過程得到了精密的調(diào)控。逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ逡逑

鉗檢測液泡磷電流逡逑磷電流的記錄主要參考了本實驗前期的研宄方法（Ｌｉｎ常水培條件下生長３周的擬南芥野生型和不同的突變體植葉，用酶解法分離出葉片的原生質(zhì)體（實驗方法見附錄尖端將細(xì)胞膜刺破釋放出液泡。然后將電極插入液泡進(jìn)。a惖緦骷鍬枷低澄粒錚鑠澹停酰歟簦椋悖歟幔恚皰澹罰埃埃洛澹粒恚穡歟椋媯椋澹蟈澹ㄅ菁鍬嫉牡緙繾瑁擔(dān)浚叮停選９嗔饕何保埃埃恚停齲常校埃�，ｌ簽冲５邋ｍ冲Ｍｅｓ－n裕繡澹ǎ穡儒澹擔(dān)擼福∫何澹保埃板澹恚灣澹齲常校埃�，６．７邋ｍＣe插澹ㄓ衛(wèi)脲澹茫幔玻ǘ任澹插澹穡停┖灣澹靛澹恚灣澹停澹螅攏裕繡澹ǎ穡儒澹罰笆品直鷯茫模嚼媧嫉鶻冢擔(dān)擔(dān)板澹恚希螅硨停擔(dān)埃板澹恚希螅懟＞菽ゅ義

本文編號：2704670