【摘要】：蛋白質糖基化是一種重要的翻譯后修飾,糖鏈與蛋白質氨基酸連接的位點稱為糖基化位點。糖蛋白質組學的分析一般包括糖基化位點的檢測,糖鏈結構的解析和完整糖肽鑒定。糖蛋白組學分析的樣品處理步驟一般包括蛋白質的酶解、糖蛋白或糖肽的富集、去糖基化和脫鹽等。然而目前的大多數方法只能單一地分析糖基化位點和糖鏈,不僅操作耗時并受到毫克級蛋白質起始量的限制。本論文基于槍頭設計了一種簡單、集成化的糖蛋白質組學技術(simple and integrated spintip-based glycoproteomics technology,Glyco-SISPROT)。該技術可以實現對毫克級別微量蛋白質樣品的處理,并在較短的處理時間內實現糖蛋白質組的全面分析。通過將強陽離子交換填料SCX,C_(18)填料和伴刀豆球蛋白凝集素填料ConA整合到槍頭內,并優(yōu)化用量和填充方式形成了Glyco-SISPROT技術。該技術能高效地處理組織樣品來源的蛋白質和多肽樣品,并實現完整糖肽、糖鏈和去糖肽的同時大規(guī)模蛋白質組學分析。通過使用多種糖苷酶組合,約1770個去糖肽和1850個糖基化位點可以被成功地從100微克的小鼠肝臟蛋白質或100微克的小鼠肝臟多肽中檢測到。其中,PNGase F糖苷酶和Endos糖苷酶都能檢測到的糖基化位點約占30%。此外,以蛋白質為起始原料,Glyco-SISPROT技術能將幾天的處理時間縮短到6個小時左右,并具有良好的操作重現性(單針小鼠肝樣品Pearson相關系數0.92)。總之,Glyco-SISPROT技術是使用有限的蛋白質作為起始原料得到最全面的糖蛋白質組信息的方法之一。該技術適用于稀有生物樣品的高靈敏度,全方面的糖蛋白質組學分析。
【圖文】：

圖 1-1 不同糖苷酶的特異性a) PNGase F 糖苷酶的特異性 b) Endo 糖苷酶的特異性2.2 集成化糖蛋白質組學的發(fā)展傳統(tǒng)的糖蛋白質分析策略的分析，包括蛋白質的提取，蛋白質的酶解，的富集，去糖肽和脫鹽等步驟都是在溶液內進行。為了實現大規(guī)模的糖基點鑒定，蛋白質的肽鍵和糖苷鍵的酶解都需要較長的反應時間。2009 年，Zhou H 等人發(fā)展了一種以 ConA 樹脂為富集材料的糖蛋白質組應器[38]。糖蛋白質在富集后轉移到糖蛋白質組反應器中，該反應器結合了質的純化、二硫鍵還原、去糖基化、胰蛋白酶酶解和分餾操作。在 5 μL 的血漿中鑒定到 41 種糖蛋白和 82 種糖肽，并將樣品處理時間縮短至 2 小時著減少了試劑的消耗。該糖蛋白反應器提供了更大的蛋白質覆蓋度和更高定準確性。但是這里的起始蛋白是已經富集分離過的糖蛋白，并沒有實現步驟在內的集成化，反應器外的富集過程中會造成部分的樣品損失。2011 年angY 等人發(fā)展了一種集成化的樣品前處理系統(tǒng)，由親水色譜柱(Hydroph

哈爾濱工業(yè)大學理學碩士學位論文的合成速率比降解速率高，，這與細胞生長的事實一致。.2 糖基化蛋白質組學的富集和酶解在生物樣品中，具有診斷和治療意義的蛋白質比其他蛋白質的含量低。由一種蛋白質的糖基化位點發(fā)生糖基化是不確定的，糖基化位點連接的糖鏈是也是不確定的，形成的糖蛋白具有不均一性和多樣性等特點。選擇有效的富集方法來降低樣品的復雜度是基于質譜技術糖蛋白質組學分析的第一富集方法的選擇對后續(xù)實驗的研究起關鍵作用。如圖 1-2 所示，常見的糖富集方法主要有凝集素富集法，酰肼化學法，親水作用色譜法和硼酸親和法。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q51

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本文編號：2703055