【摘要】：米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)由于其高度的1,3位置催化專一性,使其在造紙、食品、皮革生產(chǎn)、生物柴油等多個行業(yè)應用廣泛。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)兼具了原核生物表達系統(tǒng)表達周期短、表達量較高、易于工業(yè)化高密度培養(yǎng)的優(yōu)點以及真核表達系統(tǒng)對外源蛋白進行糖基化、磷酸化等翻譯后修飾的特點,被認為是一種表達大規(guī)模蛋白的強有力工具。但在表達RML時,未經(jīng)優(yōu)化的畢赤酵母存在兩個缺陷:(1)RML的分泌表達及表面展示都存在被酵母液泡蛋白酶降解的問題,同時畢赤酵母高密度發(fā)酵加劇了這一現(xiàn)象;(2)分泌或表面展示的RML酶活均不高,未能達到工業(yè)化生產(chǎn)需求�；诖�,本文以商業(yè)化的蛋白酶缺陷型畢赤酵母作為宿主細胞,有效改善RML被降解的問題,并通過基因工程的手段從信號肽、錨定蛋白等方法進一步提高其分泌量和展示量,為其理論研究奠定夯實的基礎。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)本文利用SignalP4.1在線預測軟件,預測出9種D值超過0.7的畢赤酵母內(nèi)源信號肽:FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9,同時篩選8種常用的畢赤酵母外源信號肽,以廣泛應用的α-交配因子(α-mating factor,α-MF)信號肽為對照,考察這些信號肽對增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和RML在PichiaPink表達系統(tǒng)的分泌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn):內(nèi)源信號肽FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介導EGFP分泌,且PRY2介導EGFP的分泌水平最高,是α-MF的2.15倍;內(nèi)源信號肽FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介導RML的分泌,且FLO10介導RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍;外源信號肽對EGFP和RML的分泌效果均沒有α-MF好。(2)以畢赤酵母GPI型細胞壁蛋白GCW21為錨定蛋白,實現(xiàn)了脂肪酶RML在蛋白酶缺陷型PichiaPink表達系統(tǒng)中的表面展示,篩選到一株含pPink-HC高拷貝質(zhì)粒的蛋白酶A缺陷型菌株GS115-ade2△-pep4△/pPink-HC-RML-GCW21,搖瓶發(fā)酵水平脂肪酶活力最高,達到121.72 U/g,比未敲除蛋白酶菌株GS115-ade2/pPink-HC-RML-GCW21提高約51.35%,比實驗室構(gòu)建的GS115/PHKA-RML-GCW21提高約46.7%。表面展示RML的最適的反應底物是C_8、最適溫度為45℃、最適pH為8.0;同時發(fā)現(xiàn)Li~+、Na~+、k~+、Mg~(2+)等金屬離子對RML酶活力有一定的激活作用。
【圖文】：

圖 1-1 從脂肪酶工程數(shù)據(jù)庫中提取的酵母和其它真菌脂肪酶的系統(tǒng)發(fā)育分析[11]Fig.1-1 Phylogenetic analysis of yeast and other fungal lipases extracted from the lipasengineering database的折疊方式雖然為大部分脂肪酶的催化活性位點提供了穩(wěn)固的骨架結(jié)構(gòu)，但是其排式、數(shù)目及角度會不同程度的影響脂肪酶二級結(jié)構(gòu)[18]。在脂肪酶活性中心有一個可構(gòu)象改變而引起界面激活效應的“α-螺旋蓋子”結(jié)構(gòu)的保護[19-20]，，這個蓋子結(jié)構(gòu)在的體系中表現(xiàn)出不同的反應，當脂肪酶處于非油水界面時，其活性中心被此蓋子結(jié)掩蓋，脂肪酶就處于一種無活性或者低活性的狀態(tài)；當酶接觸油/水界面的時候，蓋會打開并將其活性中心暴露，這種重排開啟了對活性位點絲氨酸的接近并暴露了許水殘基，使催化中心與底物結(jié)合進行反應[21-22]。4 脂肪酶的工業(yè)應用脂肪酶活性中心結(jié)構(gòu)的差異性使得它們具有廣泛的底物專一性包括脂肪酸特異性的位置選擇性、異構(gòu)體選擇性，其次微生物脂肪酶還具有反應不需要輔酶、反應條

肪酶肪酶簡介 RML（Gene Bank 中編號 A02536）是單鏈α/也是第一個獲得 3D 結(jié)構(gòu)解析的酶，由于其在菌脂肪酶之一。RML 蛋白的結(jié)構(gòu)如圖 1-2，米，pI 為 3.8[31]。其蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)包括 1~24肽；25~94（V~M）是 70 個氨基酸的前導肽，催化三聯(lián)體 Ser144、His257 和 Asp203，此催間位置上非常相近。絲氨酸 Ser 附近的序列，屬于絲氨酸水解酶類的共有特性。RML 的催 92 位）覆蓋稱為“蓋子結(jié)構(gòu)”，在疏水作用酶活性中心進行水解反應[32]，3D 脂肪酶的開
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

【參考文獻】

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本文編號：2702869