【摘要】：β-半乳聚糖酶是一類以半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖為底物,特異性水解半乳糖殘基間糖苷鍵的糖苷酶,主要包括β-1,3-、β-1,4-和β-1,6-半乳聚糖酶。β-半乳聚糖酶在多糖結構解析、構建藥用植物指紋圖譜、制備低聚半乳糖和食品品質改良等方面具有廣泛應用。其中,β-半乳聚糖酶對于富含β-半乳糖的阿拉伯半乳聚糖等多糖的結構解析至關重要。阿拉伯半乳聚糖是一種具有免疫調節(jié)、抗氧化和神經(jīng)保護等多種生理活性的多糖,具有廣闊的應用前景。分析阿拉伯半乳聚糖的精細結構,有利于其構效關系的研究和深度開發(fā)應用。本文對一種來源于草酸青霉的外切-β-1,3-半乳聚糖酶進行了重組構建、酶學性質和功能的研究,為阿拉伯半乳聚糖精細結構的研究奠定了基礎。論文主要研究結果如下:制備和純化了重組目的蛋白PoGal3。成功構建了Rosetta-pet32a(+)-pogal3重組大腸桿菌菌株和GS115-pPICZαA-pogal3重組畢赤酵母菌株,在重組畢赤酵母菌株中,外切-β-1,3-半乳聚糖酶PoGal3成功表達。利用硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析從400 mL菌液上清中成功純化出1.2 mg PoGal3。對重組畢赤酵母菌株的誘導培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,確定了BMMY誘導培養(yǎng)基pH為6.0,當菌液OD_(600 nm)達到1.0時開始誘導,甲醇加入量為2.0%(v/v),誘導時間為2 d的誘導培養(yǎng)方案,使蛋白表達量增加到原來的3.3倍。PoGal3由451個氨基酸組成,分子量為48.5 KD,等電點為6.60,是一種穩(wěn)定性較高的親水性蛋白。對PoGal3的酶學性質和功能進行了研究。首先,通過高碘酸氧化和Smith降解制備了均一性好、含有少量側鏈結構且純度較高的1,3-β-半乳聚糖AG-P-I。然后,以AG-P-I為底物測得PoGal3f粗酶的比酶活為9.3±0.9 U/mg,PoGal3f純酶的比酶活為50±3.7U/mg。PoGal3的酶學性質研究結果表明:PoGal3的最適反應溫度為40°C,最適pH為5.0,Zn~(2+)的存在可以使PoGal3的酶活增強到原來的128.6%,Li~+、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Hg~(2+)、Mn~(2+)、Ni~+、EDTA和SDS都會使酶活力減弱。底物專一性研究結果表明:PoGal3主要具有β-1,3-半乳聚糖酶活力,也具有一定的β-1,3-葡聚糖酶活力,不能降解1,4/6-β-半乳聚糖、1,4/6-β-葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖等。利用PoGal3對AG-P-I以及兩種經(jīng)典的II型阿拉伯半乳聚糖(LWAG和Acacia)進行酶解分析,結果表明,PoGal3能夠通過外切作用降解分子量較小的II型阿拉伯半乳聚糖,有潛力成為阿拉伯半乳聚糖結構分析的工具。
【圖文】：

]等從葉下珠中制備了酸性阿拉伯半乳聚糖，，經(jīng)甲基化分析和 NM乳聚糖為主鏈，在半乳糖殘基的 C3/C6 位和非還原末端檢測到木種單糖的存在。來，國內外對于阿拉伯半乳聚糖的分類較為一致。從結構特點出聚糖分為三類，分別命名為 I 型（AGI）、II 型（AGII）和 III 的結構模型如圖 1-1，它是以 1,4-β-半乳聚糖為主鏈，某些半乳被 1,5-Araf，有時也被有糖醛酸，鼠李糖等單糖取代。AGI 通常子和葉片中。AGII 是以 1,3-β-半乳聚糖為主鏈，伴隨有 1f 的支鏈取代的結構，最常見的兩種結構模型來自于阿拉伯樹膠半乳聚糖 LWAG，如圖 1-2 和 1-3，二者最大的區(qū)別在于，前者構相對更復雜。AGII 是最常見的阿拉伯半乳聚糖類型，在松柏滲出液、果實、種子、根以及離體培養(yǎng)的細胞中都能獲得，對于多。AGIII 是目前了解較少的一類，其結構模型見圖 1-4，是以各拉伯半乳聚糖側鏈的一類結構。

圖 1-2 以阿拉伯樹膠 Acacia 結構為例的 AGII 結構模型（R 基可能為 t-Rhap、1,3-β-Galp、t-Araf 或 1,3-α-Araf）? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1?6?1Galp6?1Galp6?6?1Araf3?1Arap6?1Galpn?1Araf-3 以落葉松阿拉伯半乳聚糖 LWAG 結構為例的 AGII 結構模
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q55;Q78

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本文編號：2698897