【摘要】：高山倭蛙(Nanorana parkeri)分布于青藏高原南部,是世界上現(xiàn)存分布最高的兩棲動(dòng)物,棲息地海拔在2850-5100米之間。青藏高原素有 世界屋脊‖之稱,具有寒冷和低氧等獨(dú)特的環(huán)境特征。在長期進(jìn)化過程中世居高原的動(dòng)物產(chǎn)生了一系列包括形態(tài)結(jié)構(gòu)、行為、生理以及分子水平上的適應(yīng)性特征。冬眠作為一種常見的冬季生存策略,使生物體能夠從長期的寒冷和饑餓中存活,在動(dòng)物的高海拔適應(yīng)中至關(guān)重要。迄今為止,尚未見到關(guān)于青藏高原兩棲動(dòng)物冬眠的系統(tǒng)研究。本論文以高山倭蛙為研究對象,采用生理生化、分子生物學(xué)的方法比較分析了高山倭蛙冬眠期和活動(dòng)期的形態(tài)、代謝率、心率、線粒體呼吸速率、代謝物、代謝酶活性及基因表達(dá)量、氧化應(yīng)激、氧化損傷和抗氧化保護(hù)能力的季節(jié)性差異;利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)技術(shù),探究了高山倭蛙冬眠的轉(zhuǎn)錄和代謝調(diào)控機(jī)理;通過對冬眠期高山倭蛙結(jié)冰耐受能力的研究,結(jié)合代謝組學(xué)方法,揭示高山倭蛙低溫耐受的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,冬眠期高山倭蛙的體重、身體質(zhì)量指數(shù)和肝體指數(shù)顯著增加。與活動(dòng)期相比,冬眠期高山倭蛙在8°C和20°C下的靜止代謝率分別下降約76%和66%;在冬眠期肝臟中,線粒體狀態(tài)III的呼吸速率在8°C和20°C分別下降約76%和65%,狀態(tài)IV的呼吸速率在8°C和20°C下分別下降44%和56%;在冬眠期肌肉組織中,線粒體狀態(tài)III的呼吸速率在20°C下降46%,狀態(tài)IV的呼吸速率不存在季節(jié)性差異。冬眠期肝臟和肌肉組織中細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)活性顯著降低,編碼CCO的基因COX1、COX2、COX3的mRNA水平也顯著下降。以上結(jié)果表明高山倭蛙在冬眠期發(fā)生了動(dòng)物整體和線粒體水平上的代謝抑制,這對節(jié)省能量和維持生命至關(guān)重要。然而,肝臟和肌肉組織中乳酸脫氫酶(LDH)活性在冬眠期顯著增加,編碼LDH的基因LDH(A)的mRNA水平也顯著上升,表明高山倭蛙通過上調(diào)乳酸脫氫酶來補(bǔ)償冬眠期間低溫對無氧代謝的影響。此外,肝臟和肌肉組織中高水平的糖原為高山倭蛙成功越冬提供大量的能源儲(chǔ)備。通過比較活動(dòng)期和冬眠期高山倭蛙心臟、腦、肝臟和肌肉組織中氧化應(yīng)激、氧化損傷水平和抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)高山倭蛙肝臟、心臟和肌肉組織中總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽含量在冬眠期顯著降低;肝臟、心臟和腦組織中氧化型和還原型谷胱甘肽的比例在冬眠期顯著升高。與活動(dòng)期相比,上述測定組織中硫代巴比妥酸反應(yīng)物的含量在冬眠期顯著增加;除肝臟外,其它組織中的脂質(zhì)過氧化物水平顯著上升;肝臟和腦中羰基蛋白的含量也顯著增加。此外,肝臟中抗氧化酶的活性在冬眠期顯著降低,上述測定組織中總抗氧化能力也顯著下降。這些結(jié)果表明高山倭蛙的冬眠伴隨氧化應(yīng)激,脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷也明顯增加,但抗氧化保護(hù)能力卻顯著降低。通過對活動(dòng)期和冬眠期的肝臟、肌肉組織進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析,在肝臟中,共篩選出4387個(gè)差異基因,其中冬眠期下調(diào)的基因有1992個(gè)(45%),上調(diào)基因有2395個(gè)(55%)。在肌肉組織中,共篩選出2434個(gè)差異基因,其中冬眠期下調(diào)基因有1425個(gè)(59%),上調(diào)基因有1009個(gè)(41%)。GO富集結(jié)果顯示,肝臟中上調(diào)的基因(NOX1、TNFRSF9、CD28、BTK、IRF5和IRF8等)在免疫應(yīng)答相關(guān)過程(GO:0001817、GO:0002764、GO:0002521)中顯著富集,這可能是免疫系統(tǒng)對冬季低溫影響的一種補(bǔ)償,有助于在冬眠過程中維持正常的免疫防御功能,對高山倭蛙的成功越冬是有利的。肌肉組織中與收縮功能相關(guān)的基因(LOC108794414、MYLIP、TNNT1和TNNT2等)在冬眠期顯著上調(diào),能夠有效地防止肌肉組織在冬眠期間的廢用性萎縮,并可對出眠后的活動(dòng)(如覓食、繁殖等)提供幫助。肝臟和肌肉組織中下調(diào)的基因在能量代謝過程(GO:0006631和GO:1901605等)顯著富集,而且KEGG富集結(jié)果顯示,肝臟中參與碳代謝(npr01200)、脂肪酸代謝(npr01212)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(npr00260)、甘油磷酸脂代謝(npr00564)等過程的基因表達(dá)下調(diào),這在mRNA水平上說明了高山倭蛙在冬眠期處于代謝抑制狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中COX1、COX2、COX3等表達(dá)量的下調(diào)與酶活性變化、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。代謝相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào),有助于降低冬眠過程中的能量消耗。此外,肝臟中編碼抗氧化保護(hù)酶的基因(SOD2、GSTZ1、GSTCD等)在冬眠期顯著下調(diào),這與酶活性的結(jié)果吻合,表明高山倭蛙的抗氧化保護(hù)能力在冬眠期減弱。采用GC-MS代謝組學(xué)比較分析了活動(dòng)期和冬眠期肝臟、肌肉組織中的代謝物差異,在肝臟中篩選并鑒定出35種差異代謝物,其中冬眠期上調(diào)的有13種,下調(diào)的有22種。在肌肉組織中篩選并鑒定出22種差異代謝物,其中冬眠期上調(diào)的有9種,下調(diào)的有13種。肝臟和肌肉組織中甘油磷脂代謝(npr00564)途徑中的代謝物在冬眠期上調(diào);而氨基酸合成和代謝途徑中的代謝物在冬眠期間顯著下調(diào),這些途徑包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(npr00400)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成(npr00290)、苯丙氨酸代謝(npr00360)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(npr00260)等,這很可能與高山倭蛙在冬眠期不進(jìn)食以及體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過程被抑制有關(guān)。此外,肝臟中乳酸顯著積累,表明冬眠期高山倭蛙肝臟中無氧代謝活動(dòng)劇烈,高濃度的乳酸也可以作為冬眠過程中的抗凍保護(hù)劑。肌肉組織中麥芽糖、果糖和肌醇的濃度升高,這可能與低溫保護(hù)、滲透平衡調(diào)節(jié)等作用有關(guān)。對冬眠期的高山倭蛙進(jìn)行結(jié)冰處理后發(fā)現(xiàn),與其它已發(fā)表的結(jié)冰耐受物種相比,冬眠的高山倭蛙僅表現(xiàn)出較弱的結(jié)冰耐受能力,肌肉組織在結(jié)冰處理后發(fā)生脫水,有助于降低體內(nèi)的冰含量。對結(jié)冰處理前后的肝臟、肌肉組織進(jìn)行代謝組學(xué)比較分析,在肝臟中共鑒定出33種差異代謝物,其中結(jié)冰處理后上調(diào)的代謝物有29種,下調(diào)的代謝物有4種;在肌肉組織中共鑒定出36種差異代謝物,其中結(jié)冰處理后上調(diào)的代謝物有25種,下調(diào)的代謝物有11種。結(jié)冰顯著影響肝臟和肌肉組織中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(npr00250)、精氨酸和脯氨酸代謝(npr00330)、谷氨酰胺和谷氨酸代謝(npr00471)等通路。結(jié)冰處理后,鳥氨酸、松三糖、麥芽三糖等含量顯著積累,可能參與低溫保護(hù)過程;不飽和脂肪酸含量升高,可以使膜在低溫下保持流動(dòng)性,有助于高山倭蛙耐受結(jié)冰。此外,次黃嘌呤和8-羥基-2-脫氧鳥嘌呤含量顯著升高,表明結(jié)冰誘導(dǎo)高山倭蛙處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。綜上所述,本文系統(tǒng)地研究了高山倭蛙冬眠的生理生化特征及分子調(diào)控機(jī)制,研究結(jié)果有助于闡明與冬眠相關(guān)的代謝抑制的機(jī)理,填補(bǔ)青藏高原兩棲動(dòng)物冬眠研究的空白,進(jìn)一步豐富和完善冬眠生物學(xué)研究的理論體系,為高山倭蛙和青藏高原的生態(tài)環(huán)境的保護(hù)提供參考。通過對高山倭蛙結(jié)冰耐受的研究,為青藏高原兩棲動(dòng)物低溫適應(yīng)的研究奠定基礎(chǔ),為低溫醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展提供參考。
【圖文】：

海拔 2850-5100 米的地方（圖 1-1），被認(rèn)為是世界上迄今所知海拔分布最高棲動(dòng)物[115, 116]。高山倭蛙主要生活在沼澤地、湖泊或水塘附近，成年高山倭晴天的時(shí)候喜歡隱匿于水草叢中或小水塘邊的洞穴內(nèi)，陰雨天則在水塘邊或草叢中活動(dòng)，其繁殖季節(jié)通常為 5-7 月，產(chǎn)卵量小且繁殖力較低[117, 118]。因居于高原極端環(huán)境，并能頑強(qiáng)地生活和繁衍后代，素有 高原草根‖之稱[119]前，對高山倭蛙的研究主要集中在系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和地理分布、生活史和形態(tài)學(xué)子生態(tài)學(xué)、高海拔適應(yīng)和免疫學(xué)等方面。

眠期）（圖 2-1）。采樣期間，使用電子 micro-dataloggers（Thermochron iButtons，Maxim Integrated，達(dá)拉斯）記錄高山倭蛙洞穴中的環(huán)境溫度，隨機(jī)選取 7 個(gè)洞穴，每 10 min 記錄一次，連續(xù)記錄 3 天；使用手持式電子測溫計(jì)（TM6801b；漳州市威華電子有限公司，漳州，中國）測定高山倭蛙的泄殖腔溫度（即體溫）。在采樣地附近，將高山倭蛙立即斷頭處死，取心臟、大腦、肝臟、肌肉組織并速凍于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室（蘭州大學(xué)），轉(zhuǎn)移到-80 °C 超低溫冰箱中保存，然后用于氧化應(yīng)激、氧化損傷和抗氧化保護(hù)酶活性測定實(shí)驗(yàn)；取血漿、肝臟和肌肉組織用于測定代謝物含量；另取肝臟和肌肉組織用于代謝酶活性及基因表達(dá)量、轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組檢測。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q958

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本文編號(hào)：2693279