【摘要】：目前已經(jīng)被開發(fā)的基因編輯工具按先后順序依次為:鋅指核酸內(nèi)切酶、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶以及成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)基因系統(tǒng)(CRISPR-Cas systems),它們有各自的優(yōu)缺點及適用范圍。其中CRISPRCas9系統(tǒng)因其使用簡單便捷、成本低等優(yōu)勢,是當(dāng)前使用最多的基因編輯工具。但同時它也存在不足之處:其一,適用范圍受原間隔鄰近基序(PAM)嚴(yán)格限制;其二,脫靶率比較高。所以現(xiàn)在很多學(xué)者立志于解決有關(guān)這兩方面的問題。本課題即針對III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)核酸-蛋白復(fù)合物進行研究,其優(yōu)勢主要在于它是CRISPR-Cas系統(tǒng)中唯一既能切割DNA又能切割RNA的,并且該系統(tǒng)不受PAM識別范圍的限制。該系統(tǒng)是由多個Csm蛋白以及CRISPR RNA(crRNA)組成的復(fù)合物,但目前其結(jié)構(gòu)和功能方面的信息還有很多未知。本課題主要利用多種層析方法純化高純度野生型Csm-crRNA復(fù)合物研究其結(jié)構(gòu),根據(jù)冷凍電鏡技術(shù)解析出來的結(jié)構(gòu)方面的信息對Cas10蛋白某些位點進行突變。通過純化突變型Csm-crRNA復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄回收含有部分錯配的ssRNA研究復(fù)合物的脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶功能及二者之間的關(guān)系,期望能為后續(xù)研究該系統(tǒng)的功能機制和開發(fā)新型CRIPSPR-Cas系統(tǒng)基因編輯工具提供一定的支撐。
【圖文】：

3圖 1-1 CRISPR-Cas 系統(tǒng)適應(yīng)性免疫的三個階段[11]應(yīng)階段，外源核酸上的原間隔序列被選擇、加工并整合到了對抗外源核酸的感染“記憶”，，隨后 CRISPR 基因座轉(zhuǎn)pre-crRNA），然后在重復(fù)序列處對前 crRNA 進一步剪切后是干擾階段，當(dāng)外源遺傳物質(zhì)入侵后在 crRNA 的引導(dǎo)的原間隔序列，破壞了外源遺傳物質(zhì)的完整性[11]。

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文盡管它們?nèi)狈τ苫?cas1 和 cas2 組成的保守型適應(yīng)模塊，并且 cas10 基因又存在序列差異，但它們的整體遺傳組成與 III-A 和 III-B 亞型類似，Makarova 等人認為 III-C 和 III-D 亞型具有與 III-A 和 III-B 亞型相似的干擾機制[1]。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2693145