雖然經(jīng)典遺傳操作工具在少數(shù)模式細菌中有著很好的效果,但并不適用于大多數(shù)重要病原菌在內的其它細菌。新型基因編輯技術CRISPR/Cas9由于存在表達元件復雜、脫靶效率高以及細菌存在抗Cas9分子等因素,限制了該技術在很多病原菌中的應用。因此,開發(fā)通用、簡便、高效、無痕的遺傳操作工具對于病原菌致病機制和防控技術的研究具有重要的價值和意義。多殺性巴氏桿菌對豬、牛、雞、鴨等畜禽養(yǎng)殖業(yè)危害嚴重,缺乏高效的遺傳操作工具極大限制了該病原菌致病機理的研究及防控產(chǎn)品的研發(fā)。為了研究禽多殺性巴氏桿菌的致病機理和基因工程疫苗,我們實驗室前期應用多種經(jīng)典遺傳操作系統(tǒng),如溫敏自殺系統(tǒng)、Sac B篩選系統(tǒng)、galk篩選系統(tǒng)及thy A篩選系統(tǒng)等,來構建禽多殺性巴氏桿菌基因缺失突變株但都未成功。后來采用NgAgo/gDNA系統(tǒng)成功實現(xiàn)了禽多殺性巴氏桿菌和兔多殺性巴氏桿菌靶基因的敲除和敲入,并獲得了毒力下降的疫苗候選菌株,說明NgAgo/gDNA系統(tǒng)為多殺性巴氏桿菌致病機制和防控產(chǎn)品的研究提供了遺傳操作工具,但該系統(tǒng)介導細菌基因組編輯的分子機制并不清楚。鑒于此,本論文主要研究原核生物Argonaute(pAgo)蛋白...

【文章頁數(shù)】：209 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖1Tn5轉座機制

原核生物Argonaute(pAgo)蛋白介導細菌基因組編輯及其機制研究3BarbaraMclintock在玉米中發(fā)現(xiàn)轉座子以來(GierlandSaedler1992)，轉座子作為重要的插入突變劑或分子標簽廣泛應用于細菌、真菌和其它微生物功能基因組研究中，成為重要病原菌等微生物....

圖2溶血巴氏桿菌aroA突變株的構建

華中農(nóng)業(yè)大學2020屆博士研究生學位論文10春等人采用同樣方法將Kan抗性基因表達盒與aroA基因替換，成功獲得了毒力減弱的兔多殺性巴氏桿菌aroA突變株(郭冬春等2012)。Xiao等人利用該技術將禽多殺性巴氏桿菌phoP基因替換為kan抗性基因而快速獲得突變株(Xiaoeta....

圖3利用SacB篩選系統(tǒng)構建幽門螺桿菌vacA基因缺失突變株的策略

導入幽門螺桿菌株中；其次，利用Kan抗性篩選出kan-SacB盒與vacA基因發(fā)生同源交換的菌株，即kan-SacB盒替代vacA基因的菌株；最后電轉入有vacA左右同源臂的空載質粒，在有5%蔗糖以及無Kan的條件下迫使kan-SacB盒與....

圖4galK篩選系統(tǒng)的方案

原核生物Argonaute(pAgo)蛋白介導細菌基因組編輯及其機制研究13大片段人工染色體BAC提供了遺傳操作工具，但是該系統(tǒng)必須要把galK插入到細菌染色體中，才能進行下一步的篩選過程，導致該系統(tǒng)使用時較為復雜，耗時較長。圖4galK篩選系統(tǒng)的方案。Fig.4Theschem....

本文編號：4004494