【摘要】：目的:miR-34s作為抑癌基因已經(jīng)被廣泛研究和報道。這些研究主要是基于miRNA靶向抑制細胞周期、增殖、衰老、凋亡等過程中相關分子進而產(chǎn)生的效應。本研究是從上述事件的誘因考慮,主要探索miR-34s是否參與DNA損傷修復過程、引起DNA損傷的分子機制以及對DNA損傷的效應事件,例如:周期阻滯、增殖抑制以及細胞凋亡產(chǎn)生的影響。方法:(1)用miR-34s或陰性對照miR-NC模擬物分別轉染HCT116、HT29、U2OS細胞,利用western blot檢測DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)標志物γH2AX蛋白水平。然后給予HCT116細胞相同的處理,利用免疫熒光法檢測γH2AX焦點(foci)以及彗星電泳法檢測尾部DNA百分比。(2)用miR-34s或miR-NC模擬物轉染HCT116細胞,利用流式細胞儀檢測各組細胞周期分布(n=3)。(3)用miR-34s或miR-NC模擬物轉染HCT116細胞,在倒置顯微鏡下密切觀察細胞生長狀態(tài),利用CCK-8法(n=5)和克隆形成實驗(n=3)檢測細胞增殖與存活。(4)用miR-34s或miR-NC模擬物轉染HCT116細胞,利用Annexin V-FITC/PI結合流式細胞儀檢測凋亡細胞百分比(n=3)。(5)用miR-34c-5p或miR-NC模擬物轉染HCT116細胞,利用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)檢測miR-34c-5p表達水平,利用western blot對HR和NHEJ修復相關蛋白進行檢測。(6)DR-GFP/I-SceI HR修復報告質粒與miR-34a/b/c-5p或miR-NC模擬物共轉HCT116細胞,利用流式細胞儀檢測GFP~+細胞百分比(n=3)。(7)miR-34a/b/c-5p或miR-NC模擬物與RAD51過表達質粒pcDNA3.1-MYC-RAD51或陰性對照質粒pcDNA3.1-MYC共轉染,利用western blot檢測RAD51和γH2AX蛋白表達水平。(8)利用qPCR檢測miR-34a/b/c-5p過表達后RAD51 mRNA表達水平。利用生物信息學分析miR-34s與RAD51mRNA潛在的結合位點,并利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)質粒進行驗證(n=3)。(9)用miR-34a/b/c-5p或miR-NC模擬物分別轉染HCT116 p53~(wt)和HCT116 p53~(-/-)細胞,利用western blot檢測p53、RAD51和γH2AX的蛋白水平以及利用qPCR檢測p53和RAD51的mRNA水平。結果:(1)轉染后48 h,在HCT116、HT29和U2OS細胞中miR-34s組的γH2AX蛋白水平不同程度地上調,但這三種細胞的結果不完全一致。在免疫熒光實驗和彗星電泳實驗中,miR-34s家族除了miR-34b-3p,其它家族成員均能明顯增加γH2AX焦點陽性細胞數(shù)(γH2AX焦點5)以及尾部DNA百分比。(2)于轉染后48 h和72 h,miR-34s家族除了miR-34b-3p和miR-34c-3p,其它家族成員均能明顯誘導細胞發(fā)生G1期阻滯并伴隨著S期以及G2/M期細胞比例降低。(3)上調HCT116細胞中miR-34s水平后,細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變,表現(xiàn)為:細胞由長梭形或多角形變?yōu)閳A形或橢圓形,細胞表面變得粗糙,細胞之間黏連增多以及細胞密度明顯減少。轉染后24 h,在倒置顯微鏡下已經(jīng)可以觀察到組間差異,在轉染后48 h和72 h,組間差異較為顯著。細胞增殖檢測以及細胞克隆形成實驗均顯示細胞增殖與存活能力明顯受到抑制。上述結果中miR-34b-3p作用均較弱。(4)上調HCT116細胞中miR-34s水平,miR-34s組出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡。于轉染后48 h,除了miR-34a-3p和miR-34b-3p組,其它實驗組凋亡水平均具有統(tǒng)計學差異。在轉染后72 h,各實驗組均可不同程度誘導細胞凋亡,差異具有統(tǒng)計學意義,其中miR-34a-3p和miR-34b-3p誘導細胞凋亡的能力較弱。(5)利用miR-34c-5p和miR-NC模擬物轉染HCT116細胞,于轉染后24 h和48 h,與miR-NC組相比miR-34c-5p組中miR-34c-5p表達水平上調約20倍,此外RAD51和PLK1蛋白水平均明顯下調,其它HR修復和NHEJ修復相關蛋白表達水平也發(fā)生一定程度的變化,例如RAD50和DNA-PKcs Ser~(2056)蛋白表達水平增加,以及BCL2和LIG4蛋白表達水平降低。(6)過表達miR-34a/b/c-5p或轉染si-RAD51均可明顯抑制RAD51蛋白表達水平和GFP~+細胞百分比。GFP~+細胞百分比代表HR修復效率。(7)過表達RAD51可部分逆轉miR-34a/b/c-5p誘導的高水平γH2AX。(8)qPCR結果顯示miR-34a/b/c-5p可在mRNA水平抑制RAD51。雙熒光素酶報告基因結果顯示miR-34a/b/c-5p可分別靶向結合RAD51mRNA 3’UTR序列的137-158 nt、137-159 nt以及136-158 nt位點。(9)miR-34a/b/c-5p能夠上調p53 mRNA和蛋白表達水平。在HCT116 p53~(wt)細胞中,miR-34a/b/c-5p對RAD51的抑制作用要明顯強于在HCT116 p53~(-/-)細胞中miR-34a/b/c-5p對RAD51的抑制作用,而且在HCT116 p53~(wt)細胞中γH2AX蛋白水平要明顯高于HCT116 p53~(-/-)細胞中γH2AX蛋白表達水平。討論:(1)miR-34家族均可不同程度地誘導DSBs發(fā)生,且具有細胞特異性,在HCT116細胞中miR-34b-3p的作用較弱。(2)miR-34s家族可誘導細胞發(fā)生不同程度的G1期阻滯,增殖抑制以及凋亡,這些結果與DSBs表型基本符合,表明miR-34s通過誘發(fā)DSBs進而引起G1期阻滯、抑制增殖和促進凋亡。(3)我們發(fā)現(xiàn)miR-34a/b/c-5p可在mRNA水平和蛋白水平抑制RAD51的表達。DR-GFP/I-SceI HR修復報告系統(tǒng)結果顯示miR-34a/b/c-5p和si-RAD51均能夠明顯抑制HR修復效率,過表達RAD51可部分逆轉miR-34a/b/c-5p引起的DSBs表型。這些結果充分證實了miR-34a/b/c-5p是通過抑制RAD51引起HR修復活性減弱進而引起DSBs發(fā)生。(4)miR-34a/b/c-5p對RAD51的抑制作用不僅存在直接抑制,也存在間接調控。我們利用HCT116 p53~(wt)和HCT116 p53~(-/-)細胞發(fā)現(xiàn)p53參與了miR-34a/b/c-5p對RAD51的抑制作用。
【圖文】：

軍事科學院碩士學位論文程中需要施加凋亡誘導劑，以便于調整補償。1.2 結果miR-34s 不同程度上調 γH2AX 蛋白表達水平在 DSBs 形成后，染色質中組蛋白 H2AX 的 SQE 結構域中 Ser139 殘基迅酸化形成 γH2AX。γH2AX 作為 DNA 損傷標志物已經(jīng)被廣泛證實，本研在多種細胞中（HCT116、HT29、U2OS 細胞）分別轉染 miR-34s 和陰性miR-NC 模擬物，于轉染后 48 h 收集細胞進行 western blot 檢測 γH2AX 蛋水平，，進而分析 miR-34s 能否誘導細胞內(nèi) DNA 損傷產(chǎn)生。研究結果顯示：4s 家族每個成員均可不同程度上調細胞內(nèi) γH2AX 蛋白表達水平，而且在胞類型中，該作用結果不完全一致，表明 miR-34s 家族每一個成員均可不誘導細胞內(nèi) DNA 損傷，但其作用具有細胞特異性（圖 1-1）。

軍事科學院碩士學位論文可接觸性，導致特異性 DNA 損傷修復蛋白被招募和聚集至 DNA 斷裂位點并形成焦點[11,12]�；诿庖邿晒夥軌蚯逦乜吹郊毎藘�(nèi)散在的 γH2AX 焦點，此方法已經(jīng)成為一種非常靈敏可靠的檢測 DSBs 的方法。圖 1-1 結果提示過表達miR-34s 可誘導細胞內(nèi)發(fā)生 DSBs，為了進一步驗證，我們在 HCT116 細胞中轉染 miR-34s 和陰性對照 miR-NC 模擬物，于轉染后 48 h 終止細胞培養(yǎng)并利用間接免疫熒光法分析 miR-34s 家族對 γH2AX foci 形成的影響。實驗結果顯示：在轉染后 48h，除了 miR-34b-3p，其它家族成員均能明顯增加細胞內(nèi) γH2AX 焦點（圖 1-2），該結果與圖 1-1 中 miR-34s 家族對 HCT116 細胞作用結果基本一致，進一步證實了 miR-34s 可不同程度誘導細胞內(nèi) DSBs 發(fā)生。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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