【摘要】：目的:研究人參親環(huán)素pgCyP基因在抗人參疫病和高鹽脅迫中發(fā)揮的作用,為人參抗病抗逆提供更多的選擇。研究人參親環(huán)素pgCyP基因在抗腫瘤方面的作用,為抗腫瘤方面提供更多選擇。方法:人參RNA通過TRizol法獲得,通過RT-PCR增加CyP目的基因,TA克隆、測序基因、真核表達(dá)載體構(gòu)建;農(nóng)桿菌凍融法轉(zhuǎn)化,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花卉浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥;潮霉素篩選以及分子鑒定法獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株;野生擬南芥被用作對照組進(jìn)行整株分離,對葉子和蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行抗病性分析;RT-PCR法分析對擬南芥疫病脅迫前后抗病相關(guān)基因分析。對植株在培養(yǎng)基中和土壤中進(jìn)行高鹽處理及相關(guān)生理指標(biāo)檢測。用CCK8法對三種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測。結(jié)果:第一,人參CyP目的基因成功擴(kuò)增,該基因522bp。植物表達(dá)載體pCAMBIA1303-CyP構(gòu)建成功。第二,PCR檢測顯示目的基因已經(jīng)整入到擬南芥基因組并轉(zhuǎn)錄完成;Western Bolt實(shí)驗顯示了目的基因CyP蛋白成功翻譯。第三,轉(zhuǎn)基因植物疫病菌脅迫前后CyP蛋白表達(dá)高于野生型(P0.05);疫病脅迫后,轉(zhuǎn)基因擬南芥植物生長狀態(tài)優(yōu)于野生型;轉(zhuǎn)基因植物的離體葉子對人參疫病菌抵抗能力具有更好的抗性;轉(zhuǎn)基因植物的蛋白提取物也可以減慢疫病孢子增長。第四,RT-PCR結(jié)果顯示疫病菌脅迫前的抗病基因PRs較低并且陽性植物和野生型植物的含量沒有明顯區(qū)別;疫病菌脅迫后PRs含量顯著上升,轉(zhuǎn)基因擬南芥PRs含量要比野生型更多(P0.05)。第五,抗鹽實(shí)驗結(jié)果表明:高鹽條件下,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素相對含量大幅提高,水丟失率較低,電解質(zhì)率降低。單位鮮重脯氨酸表達(dá)量上升。第六,CCK8法檢測結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因型擬南芥蛋白對三種腫瘤細(xì)胞有抑制作用。結(jié)論:人參CyP基因有一定的抗病抗逆抗腫瘤作用。
【圖文】：

3.1 CyP基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定CyP基因和pMDTM18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提質(zhì)粒并酶切。結(jié)果如圖1.1所示，單酶切后在3000-5000bp處出現(xiàn)單帶，BamHI與XbaI雙酶切后在3000-5000bp和500-700bp處各出現(xiàn)單帶，分別為pMDTM18-T載體與CyP基因片段。CyP基因插入pCAMBIA1303多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)移至 大腸桿菌中進(jìn)行菌液PCR檢測。結(jié)果如圖1.2所示，PCR產(chǎn)物在500~700bp處有明顯條帶。5.0kb3.0kb2.0kb800bp500bp300bp1.0kb700bp500bp400bp300bp200bp100bp1 DL 5000TMDNA Maker；2 載體 pCAMBIA1303 雙酶切 3 載體 pCAMBIA1303 單酶切 4 重組質(zhì)粒雙酶切；5 重組質(zhì)粒單酶切；6 重組質(zhì)粒 7DL1000TMDNAMaker；圖 1.1 酶切鑒定電泳圖1 2 3 4 5 6 7

雙酶切后在3000-5000bp和500-700bp處各出現(xiàn)單帶，分別為pMDTM18-T載體與CyP基因片段。CyP基因插入pCAMBIA1303多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)移至 大腸桿菌中進(jìn)行菌液PCR檢測。結(jié)果如圖1.2所示，，PCR產(chǎn)物在500~700bp處有明顯條帶。5.0kb3.0kb2.0kb800bp500bp300bp1.0kb700bp500bp400bp300bp200bp100bp1 DL 5000TMDNA Maker；2 載體 pCAMBIA1303 雙酶切 3 載體 pCAMBIA1303 單酶切 4 重組質(zhì)粒雙酶切；5 重組質(zhì)粒單酶切；6 重組質(zhì)粒 7DL1000TMDNAMaker；圖 1.1 酶切鑒定電泳圖1 2 3 4 5 6 7
【學(xué)位授予單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;S567.51

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1 馬任佐;人參親環(huán)素pgCyP基因在擬南芥中的克隆表達(dá)及功能分析[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2019年

本文編號：2688293