發(fā)布時間：2020-05-20 23:51

【摘要】：在自然界中,巖藻黃素占海藻中類胡蘿卜素總產(chǎn)量的10%以上,具有多種生物活性。但是在褐藻中巖藻黃素的生物合成途徑的多步反應(yīng)尚不清楚,合成代謝途徑中一些關(guān)鍵酶的編碼基因研究也不多。本研究采用RT-PCR和5'/3'RACE的方法,從褐藻裙帶菜(Undaria pinnatifida Suringar)組織中獲得了編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶(ZDS)的cDNA,命名為UpZDS基因,該酶是催化鏈孢紅素和番茄紅素形成的關(guān)鍵酶。UpZDS基因全長的cDNA包含一個長度為1821 bp的開放式閱讀框(ORF),編碼606個氨基酸殘基組成的蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,在該蛋白N末端存在一個大小為51個氨基酸殘基的葉綠體轉(zhuǎn)運肽,氨基酸序列中存在甘氨酸富集區(qū)(Gly-rich sequence),同時序列中還包含一個NAD/FAD結(jié)合域,同源性分析表明,UpZDS蛋白與其他植物的ZDS具有高度的保守性。本研究中將該開放閱讀框克隆并連接到表達載體pET-28a(+),構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-UpZDS,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)構(gòu)建工程菌,IPTG誘導(dǎo)工程菌高效表達重組ζ-胡蘿卜素去飽和酶。大腸桿菌的基因遺傳互補實驗結(jié)合高效液相色譜分析(HPLC),驗證了UpZDS基因所編碼的蛋白具有ζ-胡蘿卜素去飽和酶(ζ-carotene desaturase)的活性。同時表達UpZDS、crtE、crtB和crtP的大腸桿菌工程菌能產(chǎn)生鏈孢紅素和番茄紅素。此外,本實驗中還考察了同時轉(zhuǎn)化了crtE、crtB、crtP和UpZDS基因的大腸桿菌工程菌,在三個單因素條件下,產(chǎn)番茄紅素、鏈孢紅素和ζ-胡蘿卜素這三種類胡蘿卜素的情況。這三個單因素條件分別是不同的接種量,不同的IPTG濃度和不同的誘導(dǎo)溫度。結(jié)果表明,在不同的接種量、不同的IPTG濃度和不同的溫度下,大腸桿菌工程菌產(chǎn)三種類胡蘿卜素情況始終是ζ-胡蘿卜素最高,鏈孢紅素第二,番茄紅素最少。在接種量為唯一變量單因素實驗中,番茄紅素在接種量為1%時,其濃度達到最高,為0.637μg/mL。鏈孢紅素和ζ-胡蘿卜素在接種量為3%時,濃度達到最高,分別為2.182μg/mL和2.820μg/mL。在IPTG濃度為唯一變量的單因素實驗中,番茄紅素在IPTG濃度為0.5 mmol/L時達到最高值為0.691μg/mL。鏈孢紅素和ζ-胡蘿卜素均在IPTG濃度為0.7 mmol/L時達到最大值,分別為2.156μg/mL和2.392μg/mL。在溫度為唯一變量的單因素實驗中,番茄紅素、鏈孢紅素和ζ-胡蘿卜素均在溫度為20℃時,濃度達到最大值,分別為0.727μg/mL、2.301μg/mL和3.744μg/mL。本研究為闡明褐藻巖藻黃素的生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 提取的裙帶菜總 RNA 電泳結(jié)1:裙帶菜總 RNA；M: 5K DNA Markrophoresis of total RNAs in U. pinnaAs from U. pinnatifida Suringar; M:

圖 1.2 裙帶菜編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶全長 cDNA 的克隆。DS 基因的 cDNA 部分片段的擴增。M: 5K DNA Marker； 1: UpZDS 基因的 cDb) UpZDS 基因的 cDNA 的 5'-RACE。M: 5K DNA Marker; 1: 5'-RACE 第一輪 E 第二輪 PCR。c) UpZDS gene cDNA 的 3'-RACE。M: 5K DNA Marker; 1: 3 PCR; 2：3'-RACE 第二輪 PCR。d) UpZDS 基因的 cDNA 中 ORF 的擴增。M:
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2

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