【摘要】：中間錦雞兒(Caragan intermedia)是豆科錦雞兒屬植物,其花和根具有良好的治療功效,均可入藥;含有多種代謝產(chǎn)物,其中類黃酮化合物含量豐富。中間錦雞兒豆莢呈現(xiàn)紅色、綠色等不同顏色。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)檢測(cè)了中間錦雞兒不同顏色豆莢的代謝產(chǎn)物組成,系統(tǒng)研究了差異代謝產(chǎn)物的積累模式,分析了豆莢顏色形成可能的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制,并對(duì)苯丙烷代謝途徑中的重要酶——查爾酮合成酶(CHS)和白藜蘆醇合成酶(RS)基因進(jìn)行了克隆分析,對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。具體結(jié)果如下:1.采用LC-ESI-MS/MS技術(shù)建立了中間錦雞兒不同生長(zhǎng)時(shí)期紅色和綠色豆莢的代謝組,共檢測(cè)到557個(gè)代謝產(chǎn)物,其中包括348個(gè)已注釋的代謝產(chǎn)物,共篩選到36個(gè)含量差異明顯的代謝產(chǎn)物,其中類黃酮11個(gè)。2.紅色豆莢中總黃酮和原花青素含量明顯高于綠色豆莢。調(diào)查了中間錦雞兒紅、綠豆莢的昆蟲取食率,發(fā)現(xiàn)綠色豆莢的昆蟲取食率高于紅色豆莢,推測(cè)是由其類黃酮含量不同引起的。3.對(duì)中間錦雞兒豆莢的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了多元分析,結(jié)果表明紅、綠豆莢在代謝產(chǎn)物水平存在很大差異,代謝產(chǎn)物積累具有很強(qiáng)的發(fā)育時(shí)期特異性及顏色特異性。紅、綠豆莢差異明顯的初級(jí)代謝產(chǎn)物主要是氨基酸和核苷酸衍生物,次級(jí)代謝產(chǎn)物主要是類黃酮、酚胺和多酚類物質(zhì)。類黃酮是最主要的差異代謝產(chǎn)物。紅色豆莢中類黃酮途徑代謝產(chǎn)物含量明顯上調(diào)。紅、綠豆莢不同發(fā)育時(shí)期主要的差異代謝產(chǎn)物為核苷酸衍生物和植物激素類。4.KEGG代謝途徑富集分析顯示30日齡紅、綠豆莢的代謝產(chǎn)物主要包含在21條代謝途徑中,其中4條有顯著差異。不同發(fā)育時(shí)期綠色豆莢的代謝產(chǎn)物分布在33條代謝途徑中,其中有10條差異明顯的代謝途徑;不同發(fā)育時(shí)期紅色豆莢的代謝產(chǎn)物包含在32條代謝途徑中,其中有7條差異明顯的代謝途徑。中間錦雞兒豆莢的莽草酸代謝途徑和植物激素代謝途徑最活躍、代謝產(chǎn)物種類最多。5.利用簡(jiǎn)并引物和RACE技術(shù)從中間錦雞兒中克隆得到苯丙烷代謝途徑的兩個(gè)重要基因CiCHS和CiSS,分別編碼391和393個(gè)氨基酸,并對(duì)這兩個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)CiRS基因的表達(dá)受到干旱、NaCl、紫外等脅迫誘導(dǎo)。6.構(gòu)建了 pCanG-CiCHS植物過表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得過表達(dá)植物。過表達(dá)CiCHS基因抑制了擬南芥自身AtCHS基因的表達(dá),但過表達(dá)株系的總黃酮含量明顯增加、柚皮苷含量增加。過表達(dá)株系對(duì)紫外脅迫的耐受性明顯提高、膜脂氧化程度降低、清除自由基的能力明顯提高。CiCHS基因互補(bǔ)擬南芥tt4突變體后,轉(zhuǎn)基因植物種子的種皮呈現(xiàn)淺棕色,部分恢復(fù)了tt4突變體的表型。7.構(gòu)建了 pCanG-CiRS植物過表達(dá)載體。過表達(dá)CiRS基因抑制了擬南芥自身AtCHS基因的表達(dá),造成轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量的顯著降低,但在過表達(dá)株系中檢測(cè)到了白藜蘆醇。過表達(dá)株系對(duì)紫外脅迫的耐受性增強(qiáng)、膜脂氧化程度降低、清除自由基的能力增加。
【圖文】：

中間錦雞兒豆莢顏色形成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制及兩個(gè)相關(guān)基因功能分析生成黃酮、花青素和異黃酮等代謝物的重要中間產(chǎn)物。黃酮醇合成類黃酮與兒茶素合成途徑的橋梁，催化黃酮羥基化，生成黃酮醇類。原酶（ＤＦＲ）是花青素合成途徑的起始點(diǎn)和關(guān)鍵酶逡逑合成酶逡逑合成酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＣＨＳ，邋ＥＣ．邋２．３．１．７４）是查爾酮合酶超基因聚酮合酶（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅｓ，邋ＰＫＳ）超基因家族的核心成員［９２１，３［９３］。研究認(rèn)為ＣＨＳ最早出現(xiàn)于陸地植物和藻類植物分開之后，苔蘚。在進(jìn)化過程中，由于全基因組加倍、特異的譜系擴(kuò)張、染色體片制、轉(zhuǎn)座子復(fù)制、可能的拷貝丟失以及功能分歧等方式，逐步生成ＨＳ－ｌｉｋｅ）蛋白，如ＳＴＳ邋（苗合酶，Ｓｔｉｌｂｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＢＡＳ邋（苯亞甲ｅｎｚａｌａｃｅｔｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＣＳ邋（Ｐ丫陡酮合酶，Ａｃｒｉｄｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）、，Ｂｉｂｅｎｚｙｌ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）、２ＰＳ邋（２－卩比喃酮合酶，２－ｐｙｒｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）等

經(jīng)初步分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)莢后１０天、２０天和３０天的豆莢樣品在各個(gè)方面均存逡逑在較大差別，因此對(duì)這三組樣品進(jìn)行了代謝組檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所用紅色豆莢和綠色豆莢逡逑的樣品見圖６。豆莢采摘后，將其剝開，迅速棄去其中的豆子，只留下豆莢皮用于逡逑代謝組檢測(cè)，并立即置于液氮中進(jìn)行速凍。每個(gè)樣品為２０個(gè)隨機(jī)采摘豆莢的混合樣逡逑品，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。逡逑Ｇ１邐Ｇ２邋Ｇ３邋Ｇ４邋Ｇ５邋Ｇ６逡逑Ｉ邋Ｓ邋１１邋；邋１逡逑」？邋ｍ、逡逑Ｒ１邋Ｒ２邐Ｒ３邐Ｒ４邋Ｒ５邋Ｒ６逡逑圖６實(shí)驗(yàn)用中間錦雞兒紅、綠豆莢樣品逡逑圖中樣品分別為：Ｇ１，邋Ｒ１：結(jié)莢后３０天的豆莢；Ｇ２，邋Ｒ２：結(jié)莢后２５天的豆莢；Ｇ３，邋Ｒ３：結(jié)莢后２０天的豆莢；逡逑Ｇ４，Ｒ４：結(jié)莢后１５天的豆莢；Ｇ５，Ｒ５：結(jié)莢后１０天的豆莢；Ｇ６，Ｒ６：結(jié)莢后５天的豆莢。逡逑Ｆｉｇ．邋６邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋ｏｆ邋ｇｒｅｅｎ邋（ｔｏｐ）邋ａｎｄ邋ｒｅｄ邋（ｂｏｔｔｏｍ）邋ｐｏｄｓ邋ｏｆ邋Ｃａｒａｇａｎａ邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ逡逑Ｔｈｅ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｐｏｄｓ邋ａｒｅ邋ａｓ邋ｆｏｌｌｏｗｓ：邋ＧＩ，邋Ｒ１：邋３０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ２，邋Ｒ２：邋２５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ３，邋Ｒ３：邋２０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ４，，邋Ｒ４：逡逑１５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ５，邋Ｒ５：邋１０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ邋ａｎｄ邋Ｇ６，邋Ｒ６：邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ邋ａｆｔｅｒ邋ａｎｌｈｅｓｉｓ．逡逑２．邋２．邋２．邋２樣品制備與提取逡逑將液氮速凍后的豆莢樣品進(jìn)行冷凍干燥
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943;Q945

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 于秀敏;檸條錦雞兒LEA基因家族成員的鑒定與功能分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 韓曉敏;中間錦雞兒3個(gè)非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的克隆與功能分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2673310