【摘要】：目前肝癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升。在中國,肝癌在男性和女性癌癥患者中的死亡率分別居第二和第三位,且肝癌治療之后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,因此尋找新的治療肝癌方法刻不容緩。細(xì)胞焦亡是一種新的細(xì)胞死亡方式,GSDME基因是細(xì)胞焦亡的重要基因,也是一種抑癌基因。為探索GSDME基因在肝癌靶向治療中的作用,利用實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的GP73調(diào)控的溶瘤腺病毒GD55作為載體,構(gòu)建了攜帶GSDME基因的溶瘤腺病毒GD55-GSDME,并進(jìn)行了其單獨(dú)或聯(lián)合化療藥物Dox抗肝癌細(xì)胞生長的研究。本研究中,首先通過qRT-PCR、Western blot和免疫組化檢測GSDME基因在肝癌細(xì)胞和臨床肝癌組織中的本底表達(dá);利用基因工程方法構(gòu)建了攜帶GSDME基因的溶瘤腺病毒GD55-GSDME;通過MTT、LDH和結(jié)晶紫染色檢測了 GD55-GSDME和Dox對肝癌細(xì)胞生長的影響;Western blot檢測了 GD55-GSDME和Dox處理肝癌細(xì)胞后GSDME、GSDME-N和caspase3等蛋白表達(dá)量的變化;Hoechst33342和流式檢測了 GD55-GSDME和Dox對細(xì)胞凋亡的影響;動物模型檢測GD55-GSDME聯(lián)合Dox對肝癌細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果表明,GD55-GSDME和Dox聯(lián)合處理腫瘤細(xì)胞時(shí),細(xì)胞會并發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡,而且Dox和病毒聯(lián)合可以更多細(xì)胞發(fā)生焦亡,比任一單一處理更有效抑制肝癌細(xì)胞生長。綜上,我們構(gòu)建了 GP73啟動子調(diào)控且攜帶GSDME基因的新型溶瘤腺病毒GD55-GSDME,在體內(nèi)外能特異性靶向肝癌細(xì)胞并抑制肝癌細(xì)胞的生長,與Dox聯(lián)合具有較好的協(xié)同效應(yīng),并且對正常細(xì)胞的影響較小。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),溶瘤腺病毒GD55-GSDME聯(lián)合Dox能引起肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡,更加有效地抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞,有望為肝癌的臨床治療提供新思路和新技術(shù)。
【圖文】：

３．１．１邐ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定逡逑利用Ｉ和／／／？ｄ邋ＩＩＩ分別將ｐＣＡ１３質(zhì)粒和ｐＣＳ２－ＧＳＤＭＥ進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行逡逑連接和轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，電泳圖如圖３．１，明顯可以看到，泳道１、２和３逡逑在１５００邋ｂｐ處皆有一條帶，與基因大小相符；上面７０００邋ｂｐ有一條帶與ｐＣＡ〗３載逡逑體大小相符，說明ＰＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ質(zhì)粒構(gòu)建重組成功。逡逑Ｍ邋１邐２邐３逡逑５０００ｂｐ逡逑ｉ５00ｂｐ邐＾逡逑ｌＯＯＯｂｐ逡逑５００ｂｐ逡逑圖３．１邋ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ質(zhì)粒酶切鑒定圖逡逑Ｆｉｇ邋３．１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｂｙ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑Ｍ：邋１５０００邋ｂｐ邋Ｍａｒｋｅｒ；泳道１、２、３為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逡逑３．１．２邐ｐＧＤ５５－ＧＳＤＭＥ重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定逡逑分別利用單酶切ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ和ｐＧＤ５５質(zhì)粒，酶切后做連接和轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)逡逑化產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，電泳如圖３．２所示，４個(gè)泳道在１５００邋ｂｐ處皆有一條帶，為ＧＳＤＡｆｆｉ逡逑基因大��；在１００００匕口左右也有一條帶，顯示為卩００５５質(zhì)粒大小，證明卩００５５－０５０＼＾逡逑質(zhì)粒重組成功。逡逑２６逡逑

Ｆｉｇ邋３．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＧＤ５５－ＧＳＤＭＥ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｂｙ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑Ｍ：邋１５０００邋ｂｐ邋Ｍａｒｋｅｒ，，泳道邋１、２、３、４邋為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逡逑因組的構(gòu)建與鑒定逡逑ＰＧＤ５５－ＧＳＤＭＥ質(zhì)粒用Ｐｍｅ邋Ｉ酶切線性化，去磷酸化后轉(zhuǎn)化，用Ｋａｎ平板篩選，挑取單克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，再Ｉ酶對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，如圖３．３所示，４個(gè)泳道均有５條ｂｐ、４８００邋ｂｐ、７０００邋ｂｐ和２００００邋ｂｐ左右，說明同源重組質(zhì)粒構(gòu)Ｍ邋１邐２邐３邐４逡逑１５０００ｂｐ邐■邋’逡逑ｌＱＯＯＯｂｐ＾＾ｌＫ邋ｓ；邋ｉ－邐＾逡逑ＳＯＯＯｂｐ＾＾Ｒ１，邋＇邋＾邐￡邋Ｊ邋哢逡逑１５００ｂｐ｜逡逑ｌＯＯＯｂｐｌ逡逑５００ｂｐ邋Ｉ邐｜逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R735.7;Q78

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本文編號：2672708