【摘要】：香鱗毛蕨[Dryopteris fragrans(L.)Schott]是生長在高寒地區(qū)的一種鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物,在民間,用香鱗毛蕨葉片來治療皮膚病已具有幾十年的歷史,香鱗毛蕨作為一種野生藥用資源植物,具有重要的應(yīng)用前景。近年來研究表明,香鱗毛蕨中具有酚類、萜類等多種化合物。本實驗室前期的工作已經(jīng)證明,香鱗毛蕨的萜類代謝產(chǎn)物具有抑菌和抗腫瘤等功效。但目前關(guān)于蕨類植物的萜類代謝途徑還未見報道。因此,對香鱗毛蕨及其萜類代謝通路的研究具有重大意義。植物中萜類物質(zhì)的生物合成在很大程度上受到昆蟲或微生物誘導(dǎo)。生產(chǎn)實踐中,經(jīng)常采用外源施加茉莉酸類物質(zhì),來模擬昆蟲與真菌病害以誘導(dǎo)植物的間接防御反應(yīng)來研究萜類代謝產(chǎn)物的積累。MYC2是植物響應(yīng)茉莉酸類代謝通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)控植物體積累萜類物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)中具有重要的作用。因此,本研究以茉莉酸類激素JAs作為外源激素處理香鱗毛蕨葉片,調(diào)控香鱗毛蕨MYC2轉(zhuǎn)錄因子的表達,并通過香鱗毛蕨MYC2在擬南芥中的異源表達來探究香鱗毛蕨萜類代謝途徑。本文主要的試驗結(jié)果如下:1.從試驗室之前獲得的香鱗毛蕨全株系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到注釋為MYC2基因的片段。從4個基因片段中篩選出一個作為香鱗毛蕨MYC2基因的核心片段�；诤诵钠涡蛄�,通過RACE技術(shù),克隆獲得基因全長3130bp,開放閱讀框2496bp,將其命名為DfMYC2,在NCBI上的基因登錄號為MK193871。2.選取香鱗毛蕨根、根狀莖、葉柄及葉片對DfMYC2基因進行表達量分析,結(jié)果顯示其在葉片中表達量最高,葉柄表達量其次,在根和根狀莖中表達量最低。之后選用MeJA對香鱗毛蕨進行外源處理,結(jié)果顯示,香鱗毛蕨MYC2基因在MeJA處理后隨時間變化表達量先升高后降低。3.運用生物信息學(xué)技術(shù)分析并預(yù)測香鱗毛蕨MYC2蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)香鱗毛蕨MYC2蛋白編碼831個氨基酸,包含三種二級結(jié)構(gòu)類型,存在信號肽,屬于分泌型蛋白,不存在卷曲結(jié)構(gòu)和信號肽。4.構(gòu)建植物表達載體對擬南芥(Arabidopsis thaliana)野生型植株(哥倫比亞生態(tài)型Col-0)進行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得DfMYC2基因過表達植株,觀察其表型,發(fā)現(xiàn)過表達植株要比同期的野生型植株生長更茂盛,說明DfMYC2基因表達能夠促進擬南芥植株的生長;過表達植株葉柄上的表皮毛數(shù)量明顯多于野生型植株,且在過表達擬南芥植株中倍半萜合酶基因TPS11和TPS21表達量升高,證明DfMYC2基因在擬南芥中同樣能夠促進倍半萜合酶基因的表達。5.通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得擬南芥AtMYC2基因缺失型植株,對其進行篩選并觀察表型。結(jié)果顯示AtMYC2基因缺失型植株要比同期的野生型擬南芥生長更慢且葉柄上的表皮毛數(shù)量明顯減少,且缺失型植株中倍半萜合酶基因TPS11和TPS21表達量明顯降低,說明AtMYC2基因不僅影響擬南芥植株生長和表皮毛發(fā)育,還影響倍半萜合酶基因的表達。6.將DfMYC2基因轉(zhuǎn)入到AtMYC2缺失型純合體,獲得DfMYC2互補AtMYC2缺失型擬南芥。結(jié)果發(fā)現(xiàn),互補型植株TPS11和TPS21基因表達量比缺失型植株略有升高,但比野生型低,植株大小和表皮毛數(shù)量與野生型植株沒有明顯差異,說明DfMYC2基因和AtMYC2基因在植物生長、表皮毛發(fā)育和影響倍半萜代謝積累的相關(guān)功能上有相似之處。7.將DfMYC2基因轉(zhuǎn)入到本氏煙草(Nicotiana benthamiana)中進行亞細胞定位分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DfMYC2基因主要在細胞核中表達。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;S567.239

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本文編號：2671465