【摘要】：轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,包括mRNA的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位、轉(zhuǎn)換以及翻譯,是調(diào)控基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。最近幾年,越來(lái)越多的證據(jù)表明選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)通過(guò)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度3’UTR(3’untranslated region,3’UTR)變異體,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。APA對(duì)mRNA的定位、穩(wěn)定性及翻譯效率有重要影響。牛AAMDC(Adipogenesis associated Mth938 domain containing)基因位于29號(hào)染色體上,包含4個(gè)外顯子,編碼122個(gè)氨基酸,結(jié)構(gòu)域分析表明AAMDC包含一個(gè)Mth938結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是由熱自養(yǎng)甲烷桿菌基因組編碼的一種未知蛋白結(jié)構(gòu)域,其功能尚未明確。目前影響AAMDC基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控事件也有待闡明。本研究利用3’RACE對(duì)牛AAMDC基因變異體進(jìn)行了克隆與鑒定。首先,通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)探究AAMDC不同的3’UTR對(duì)蛋白表達(dá)的影響。其次,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染表達(dá)載體,檢測(cè)不同的3’UTR對(duì)mRNA穩(wěn)定性及翻譯效率的影響。然后,利用Western blot和qRT-PCR方法進(jìn)行了AAMDC基因與microRNAs(miRNAs)相互作用的探究。最后,分析了AAMDC長(zhǎng)短變異體在牛前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的表達(dá)譜及其對(duì)牛前脂肪細(xì)胞分化的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)通過(guò)APA和可變剪接(Alternative splicing,AS),牛AAMDC基因產(chǎn)生三種不同的變異體。其GenBank登錄號(hào)分別為:MK576046,MK576047和MK576048。(2)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明AAMDC長(zhǎng)短3’UTR有不同的調(diào)控能力,短3’UTR能夠促進(jìn)蛋白表達(dá)。(3)將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明短變異體的mRNA穩(wěn)定性及翻譯效率顯著高于其他變異體。(4)miR-2428和miR-664a能夠直接與長(zhǎng)變異體的3’UTR結(jié)合并抑制其表達(dá),表明由APA介導(dǎo)的3’UTR變短使AAMDC短變異體缺少了miR-2428和miR-664a的結(jié)合位點(diǎn),從而逃避了miRNA的抑制作用。(5)利用qRT-PCR分析了AAMDC長(zhǎng)短變異體在牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)譜,結(jié)果表明隨著脂肪分化,AAMDC長(zhǎng)短變異體及長(zhǎng)變異體的表達(dá)量不斷增高。將長(zhǎng)短變異體轉(zhuǎn)染到牛前脂肪細(xì)胞中,油紅O染色和qRT-PCR結(jié)果表明AAMDC短變異體能夠促進(jìn)牛前脂肪細(xì)胞分化�？傊�,本研究闡明了一個(gè)新的由APA和miR-2428和miR-664a調(diào)節(jié)AAMDC的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。同時(shí)表明AAMDC短變異體能夠促進(jìn)牛前脂肪細(xì)胞分化,為進(jìn)一步探究AAMDC的生理功能和脂肪生成的機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 mRNA 3’末端加工機(jī)制[8]Fig. 1-1 mRNA 3’end processing machinery代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)選擇性多聚腺苷酸化現(xiàn)象普遍存多個(gè) poly（A）位點(diǎn)，產(chǎn)生不同編碼能力或不同 3’UTR 的轉(zhuǎn)人類(lèi)基因能夠利用 APA 產(chǎn)生 mRNA 變異體，果蠅、線蟲(chóng)、斑基因存在 APA 事件[1,8-11]。APA 事件主要存在兩類(lèi)：UTR-APA（native polyadenylation，UTR-APA）和 CR-APA （coding regtion，CR-APA）（圖 1-2）。在 UTR-APA 事件中，PAS 位于 mRN生包含不同長(zhǎng)度 3’UTR 但編碼同一蛋白質(zhì)的變異體。因?yàn)?3A 結(jié)合蛋白（RNAbinding proteins，RBPs）和 miRNAs 的結(jié)合的改變，UTR-APA 可能會(huì)使 mRNA 定位、穩(wěn)定性及翻譯效率PA，PAS 位于 mRNA 的內(nèi)含子或外顯子中，因此 CR-APA 能。綜上所述，UTR-APA 能夠在數(shù)量上影響基因表達(dá)，而 CR

圖 1-2 UTR-APA 和 CR-APAmRNA 示意圖[8]Fig. 1-2 Schematic illustration of UTR-APAand CR-APAof mRNA.注：外顯子用矩形表示；內(nèi)含子用細(xì)線表示。te: Exons are represented by rectangular squares; Introns are represented by 在 mRNA 定位、穩(wěn)定性和翻譯效率中的功能A 定位的調(diào)控 定位是細(xì)胞時(shí)空調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵，，結(jié)合到 3’UTR 元件的 RBP使 mRNA 定位到不同的亞細(xì)胞區(qū)室。APA 產(chǎn)生的不同 3’UTR位能力。腦源性神經(jīng)因子（brain-derived neurotrophic factor，B因子，在樹(shù)突發(fā)生和突觸可塑性的活性依賴形式中發(fā)揮作用。作用下產(chǎn)生選擇性 3’UTR 異構(gòu)體，短的 3’UTR 異構(gòu)體將 BDN
【學(xué)位授予單位】：聊城大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2663125