【摘要】：海藻糖是一種天然低聚二糖,是許多植物、昆蟲和微生物在逆性環(huán)境下的應(yīng)激代謝物,具有低卡、穩(wěn)定、保濕和防曬等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。海藻糖主要是以淀粉為底物經(jīng)麥芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)連續(xù)作用獲得,但是目前報道的這兩種酶的表達宿主大多為大腸桿菌,其含有的內(nèi)毒素不利于食品酶的制備,而枯草芽孢桿菌不分泌內(nèi)毒素,且發(fā)酵周期適中、培養(yǎng)方便,是食品級酶制劑表達宿主的最佳選擇之一。本實驗室前期構(gòu)建了重組表達Athrobacter ramosus S34來源的MTSase和MTHase的B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y和B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z,本研究對其進行搖瓶及3-L罐水平的發(fā)酵優(yōu)化,同時分別研究了兩種重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。構(gòu)建了重組菌B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z和B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z,并對后者進行搖瓶及3-L罐發(fā)酵優(yōu)化。最后優(yōu)化了海藻糖的制備工藝,并將此工藝進行中試試驗,隨后對海藻糖的分離提取條件做初步探索。主要研究結(jié)果如下:(1)將重組菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y進行搖瓶發(fā)酵,考察了重組MTSase的pH溫度性質(zhì)。結(jié)果表明:該酶的最適溫度為45℃、pH 6.0,45℃的半衰期為76 h,與大腸桿菌表達獲得的酶相似。進一步優(yōu)化重組菌的培養(yǎng)基組分,結(jié)果表明:其最適碳源和氮源為葡萄糖5 g·L~(-1)、工業(yè)蛋白胨10 g·L~(-1)和玉米漿25 g·L~(-1),此時重組MTSase的酶活為63.2 U·mL~(-1);在此基礎(chǔ)上,探究重組菌在3-L發(fā)酵罐中的發(fā)酵pH及補料碳氮比。結(jié)果表明:在pH 7.0,葡萄糖為補料碳源,工業(yè)蛋白胨和玉米漿為補料氮源,C/N為1:1條件下酶活最高為1139.2 U·mL~(-1),比搖瓶發(fā)酵優(yōu)化前提高了18倍。(2)將重組菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z進行搖瓶發(fā)酵,考察了重組MTHase的pH溫度性質(zhì)。結(jié)果表明:該酶的最適溫度為55℃、pH 5.5,45℃的半衰期為4 h,與大腸桿菌表達獲得的酶相似。進一步優(yōu)化重組菌的培養(yǎng)基組分及木糖誘導(dǎo)濃度,結(jié)果表明:最適碳源和氮源為甘油5 g·L~(-1)、工業(yè)蛋白胨25 g·L~(-1)和大豆蛋白胨10 g·L~(-1),最適誘導(dǎo)濃度為5 g·L~(-1)木糖,此時重組MTHase的酶活為74.7 U·mL~(-1)。在此基礎(chǔ)上,探究重組菌3-L發(fā)酵罐中的木糖誘導(dǎo)流速及補料碳氮比。結(jié)果表明:以甘油為補料碳源、工業(yè)蛋白胨和大豆蛋白胨為補料氮源,C/N為2:1,木糖誘導(dǎo)速率為0.5 g·L~(-1)·h~(-1)的條件下發(fā)酵,酶活最高為294.2 U·mL~(-1),僅為搖瓶發(fā)酵優(yōu)化前的3.9倍。該重組菌在3-L罐發(fā)酵40 h后酶活迅速降低,存在發(fā)酵放大不穩(wěn)定的問題。(3)為了考察不同B.subtilis宿主菌對MTHase產(chǎn)量的影響,構(gòu)建重組菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z和B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z,其中重組菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z酶活更高為54.7 U·mL~(-1)。接著對該重組菌的培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化,結(jié)果表明:最適碳源和氮源為甘油5 g·L~(-1)、大豆蛋白胨25 g·L~(-1)和玉米漿5 g·L~(-1),此時重組MTHase的酶活為71.3 U·mL~(-1)。并在3-L罐水平上優(yōu)化該重組菌的補料碳氮比。結(jié)果表明:以甘油為補料碳源,大豆蛋白胨和玉米漿為補料氮源,補料C/N為1:1時,酶活最高為816.2 U·mL~(-1),是重組菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z最高酶活的2.8倍。(4)在pH 6.0、45℃的條件下,以DE值17-20、濃度為200 g·L~(-1)的大米淀粉為底物,經(jīng)上述重組酶催化40 h海藻糖轉(zhuǎn)化率為52.6%。由于體系中含有較多的麥芽三糖和麥芽糖等副產(chǎn)物,利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的歧化活性將其聚合度延長,提高底物利用率。與Bacillus stearothermophilus來源的α/β-CGTase復(fù)配作用后,催化周期縮短至30 h,轉(zhuǎn)化率提高至68.6%。在此優(yōu)化基礎(chǔ)上進行10噸罐中試試驗,轉(zhuǎn)化率為65.4%。隨后對海藻糖進行分離提取,分別考察確定了活性炭脫色、離交分離及濃縮結(jié)晶的最適條件,海藻糖最終收率為80.1%。
【圖文】：

α,α-海藻糖結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Thestructureoftrehalose

[29]。隨后，日本林原研究所從節(jié)桿菌(Arthrabaccter sp. Q36)中分離出MTSase和MTHase，二者能聯(lián)合先后作用于麥芽寡糖生成海藻糖。其作用機理如圖1-2所示，MTSase將麥芽寡糖或直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽寡糖基海藻糖，接著在MTHase水解的作用下，得到一分子海藻糖和減少兩個葡萄糖的麥芽寡糖，如此循環(huán)作用至麥芽寡糖的DP≤2[30]，對海藻糖的轉(zhuǎn)化率在80%以上。雙酶法反應(yīng)的條件溫和，操作簡便且生產(chǎn)成本較低，是目前海藻糖制備的最佳選擇，國內(nèi)外多家企業(yè)已經(jīng)用于工業(yè)化海藻糖制備生產(chǎn)[10]的。圖 1-2 雙酶法制備海藻糖的?
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孟建華;;日兩家公司計劃用基因重組菌工業(yè)生產(chǎn)酶[J];生物工程進展;1988年01期

2 金梅林;;預(yù)防新生仔豬腸毒性大腸桿菌病的DNA重組菌毛菌苗的研制及保護效果[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1989年04期

3 和曉賢;李青云;唐愛星;劉幽燕;;源自重組菌BL21-pET28a-cdE降氰酶的基本性質(zhì)研究[J];廣西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2018年03期

4 陳璇;劉松;馮岳;堵國成;陳堅;;常壓室溫等離子誘變選育L-天冬酰胺酶高產(chǎn)重組菌[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報;2016年05期

5 葉勤;基因重組菌高密度培養(yǎng)研究[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2003年05期

6 諸葛斌;堵國成;諸葛健;陳堅;;重組菌產(chǎn)堿性果膠酯裂解酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J];微生物學(xué)報;2008年01期

7 吳曉燕;郭妍;惠長野;陳劍輝;高朝賢;曾新軍;;PbrR大腸埃希菌外膜展示株體內(nèi)外生長特性[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2017年07期

8 張曉梅;諸葛斌;許正宏;竇文芳;黃瑞;許贛榮;;產(chǎn)3-羥基丙酸重組菌的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化甘油的研究[J];生物技術(shù)通報;2009年08期

9 孫金鳳;王正祥;;新型產(chǎn)乙醇重組菌利用葡萄糖和木糖的乙醇發(fā)酵[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2008年05期

10 趙建芬;韋壽蓮;張廣;;重組菌轉(zhuǎn)化香蘭素生產(chǎn)香蘭素酸的研究[J];食品科學(xué);2009年23期

相關(guān)會議論文 前6條

1 黃江;張明明;倫鏡盛;黃通旺;胡忠;;Enterobacter sp.CN1產(chǎn)氫代謝調(diào)控的初步研究[A];廣東省遺傳學(xué)會第九屆代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文及摘要匯編[C];2014年

2 王玉梅;劉暢;蒙沖;郭風(fēng)云;;HEV ORF_2重組菌菌種的穩(wěn)定性及融合蛋白的應(yīng)用[A];新世紀 新機遇 新挑戰(zhàn)——知識創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（上冊）[C];2001年

3 沙沖;喻曉蔚;徐巖;郅巖;孔宇;;通過基因拷貝數(shù)優(yōu)化及重組菌表型優(yōu)化提高華根霉CCTCC M201021脂肪酶proRCL在畢赤酵母中的表達水平[A];第八屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

4 孟慶玲;才學(xué)鵬;喬軍;景志忠;張艷;田廣孚;郭愛疆;;中國白兔白介素-10基因的克隆、表達及其多克隆抗體的制備[A];中國實驗動物學(xué)會第七屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

5 王賢波;王麗鴛;成浩;周健;;茶氨酸生物合成工程菌的構(gòu)建[A];第四屆海峽兩岸茶業(yè)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

6 丁軻;余祖華;程相朝;張春杰;王天奇;;綠色熒光蛋白基因作為示蹤基因標記乳酸桿菌[A];第四屆第九次全國學(xué)術(shù)研討會暨飼料和動物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（上冊）[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳新愛;基因工程菌培養(yǎng)若干重要問題的研究[D];浙江大學(xué);2002年

2 張大偉;微生物中生產(chǎn)輔酶Q_(10)的研究[D];北京化工大學(xué);2007年

3 丁慶豹;核苷磷酸化酶的克隆、表達與應(yīng)用[D];華東理工大學(xué);2010年

4 張曉梅;遺傳改造Zymomonas mobilis代謝木糖及其木糖醇產(chǎn)生機制的研究[D];山東大學(xué);2009年

5 羅紫臣;纖維素酶的分泌表達及其在生物煉制中的應(yīng)用[D];華東理工大學(xué);2015年

6 呂桂善;乳源抗高血壓生物活性肽在大腸桿菌中表達的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

7 王振華;豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組乳酸乳球菌粘膜免疫疫苗的構(gòu)建及免疫原性評價[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

8 胡靜濤;新城疫病毒HN基因重組乳酸菌抗小鼠結(jié)腸癌及免疫機制的初步研究[D];吉林大學(xué);2015年

9 沙沖;華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶在異源宿主中的高效分泌表達[D];江南大學(xué);2015年

10 秦秀林;構(gòu)建 GAP啟動子文庫提高重組畢赤酵母S-腺苷甲硫氨酸合成[D];華東理工大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄒亮;Pantoea dispersa蔗糖異構(gòu)酶在芽孢桿菌中的表達及發(fā)酵優(yōu)化[D];江南大學(xué);2019年

2 封金云;Athrobacter ramosus的MTSase和MTHase的重組表達及應(yīng)用[D];江南大學(xué);2019年

3 張小可;雙基因共表達策略對高山被孢霉重組菌合成EPA的作用研究[D];江南大學(xué);2018年

4 和曉賢;產(chǎn)降氰酶重組菌BL21-pET28a-cdE的氰代謝及特性研究[D];廣西大學(xué);2017年

5 范如婷;聚3-羥基丙酸重組菌構(gòu)建及代謝調(diào)控[D];北京化工大學(xué);2015年

6 黃文晶;高產(chǎn)堿性蛋白酶重組菌及其發(fā)酵性能[D];江南大學(xué);2012年

7 周小艷;甲酸脫氫酶基因的克隆表達及重組菌的高密度培養(yǎng)[D];浙江大學(xué);2008年

8 吳小芳;雙重組菌偶聯(lián)不對稱還原制備（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[D];江西師范大學(xué);2013年

9 董坤;產(chǎn)谷胱甘肽釀酒酵母重組菌的構(gòu)建及發(fā)酵研究[D];山東大學(xué);2012年

10 邵坤彥;重組菌中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶表達及純化的研究[D];中南民族大學(xué);2012年

，

本文編號：2661202