【摘要】：海藻糖是一種天然低聚二糖,是許多植物、昆蟲和微生物在逆性環(huán)境下的應(yīng)激代謝物,具有低卡、穩(wěn)定、保濕和防曬等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。海藻糖主要是以淀粉為底物經(jīng)麥芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)連續(xù)作用獲得,但是目前報(bào)道的這兩種酶的表達(dá)宿主大多為大腸桿菌,其含有的內(nèi)毒素不利于食品酶的制備,而枯草芽孢桿菌不分泌內(nèi)毒素,且發(fā)酵周期適中、培養(yǎng)方便,是食品級(jí)酶制劑表達(dá)宿主的最佳選擇之一。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了重組表達(dá)Athrobacter ramosus S34來(lái)源的MTSase和MTHase的B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y和B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z,本研究對(duì)其進(jìn)行搖瓶及3-L罐水平的發(fā)酵優(yōu)化,同時(shí)分別研究了兩種重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。構(gòu)建了重組菌B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z和B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z,并對(duì)后者進(jìn)行搖瓶及3-L罐發(fā)酵優(yōu)化。最后優(yōu)化了海藻糖的制備工藝,并將此工藝進(jìn)行中試試驗(yàn),隨后對(duì)海藻糖的分離提取條件做初步探索。主要研究結(jié)果如下:(1)將重組菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,考察了重組MTSase的pH溫度性質(zhì)。結(jié)果表明:該酶的最適溫度為45℃、pH 6.0,45℃的半衰期為76 h,與大腸桿菌表達(dá)獲得的酶相似。進(jìn)一步優(yōu)化重組菌的培養(yǎng)基組分,結(jié)果表明:其最適碳源和氮源為葡萄糖5 g·L~(-1)、工業(yè)蛋白胨10 g·L~(-1)和玉米漿25 g·L~(-1),此時(shí)重組MTSase的酶活為63.2 U·mL~(-1);在此基礎(chǔ)上,探究重組菌在3-L發(fā)酵罐中的發(fā)酵pH及補(bǔ)料碳氮比。結(jié)果表明:在pH 7.0,葡萄糖為補(bǔ)料碳源,工業(yè)蛋白胨和玉米漿為補(bǔ)料氮源,C/N為1:1條件下酶活最高為1139.2 U·mL~(-1),比搖瓶發(fā)酵優(yōu)化前提高了18倍。(2)將重組菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,考察了重組MTHase的pH溫度性質(zhì)。結(jié)果表明:該酶的最適溫度為55℃、pH 5.5,45℃的半衰期為4 h,與大腸桿菌表達(dá)獲得的酶相似。進(jìn)一步優(yōu)化重組菌的培養(yǎng)基組分及木糖誘導(dǎo)濃度,結(jié)果表明:最適碳源和氮源為甘油5 g·L~(-1)、工業(yè)蛋白胨25 g·L~(-1)和大豆蛋白胨10 g·L~(-1),最適誘導(dǎo)濃度為5 g·L~(-1)木糖,此時(shí)重組MTHase的酶活為74.7 U·mL~(-1)。在此基礎(chǔ)上,探究重組菌3-L發(fā)酵罐中的木糖誘導(dǎo)流速及補(bǔ)料碳氮比。結(jié)果表明:以甘油為補(bǔ)料碳源、工業(yè)蛋白胨和大豆蛋白胨為補(bǔ)料氮源,C/N為2:1,木糖誘導(dǎo)速率為0.5 g·L~(-1)·h~(-1)的條件下發(fā)酵,酶活最高為294.2 U·mL~(-1),僅為搖瓶發(fā)酵優(yōu)化前的3.9倍。該重組菌在3-L罐發(fā)酵40 h后酶活迅速降低,存在發(fā)酵放大不穩(wěn)定的問(wèn)題。(3)為了考察不同B.subtilis宿主菌對(duì)MTHase產(chǎn)量的影響,構(gòu)建重組菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z和B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z,其中重組菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z酶活更高為54.7 U·mL~(-1)。接著對(duì)該重組菌的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:最適碳源和氮源為甘油5 g·L~(-1)、大豆蛋白胨25 g·L~(-1)和玉米漿5 g·L~(-1),此時(shí)重組MTHase的酶活為71.3 U·mL~(-1)。并在3-L罐水平上優(yōu)化該重組菌的補(bǔ)料碳氮比。結(jié)果表明:以甘油為補(bǔ)料碳源,大豆蛋白胨和玉米漿為補(bǔ)料氮源,補(bǔ)料C/N為1:1時(shí),酶活最高為816.2 U·mL~(-1),是重組菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z最高酶活的2.8倍。(4)在pH 6.0、45℃的條件下,以DE值17-20、濃度為200 g·L~(-1)的大米淀粉為底物,經(jīng)上述重組酶催化40 h海藻糖轉(zhuǎn)化率為52.6%。由于體系中含有較多的麥芽三糖和麥芽糖等副產(chǎn)物,利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的歧化活性將其聚合度延長(zhǎng),提高底物利用率。與Bacillus stearothermophilus來(lái)源的α/β-CGTase復(fù)配作用后,催化周期縮短至30 h,轉(zhuǎn)化率提高至68.6%。在此優(yōu)化基礎(chǔ)上進(jìn)行10噸罐中試試驗(yàn),轉(zhuǎn)化率為65.4%。隨后對(duì)海藻糖進(jìn)行分離提取,分別考察確定了活性炭脫色、離交分離及濃縮結(jié)晶的最適條件,海藻糖最終收率為80.1%。
【圖文】：

α,α-海藻糖結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Thestructureoftrehalose

[29]。隨后，日本林原研究所從節(jié)桿菌(Arthrabaccter sp. Q36)中分離出MTSase和MTHase，二者能聯(lián)合先后作用于麥芽寡糖生成海藻糖。其作用機(jī)理如圖1-2所示，MTSase將麥芽寡糖或直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽寡糖基海藻糖，接著在MTHase水解的作用下，得到一分子海藻糖和減少兩個(gè)葡萄糖的麥芽寡糖，如此循環(huán)作用至麥芽寡糖的DP≤2[30]，對(duì)海藻糖的轉(zhuǎn)化率在80%以上。雙酶法反應(yīng)的條件溫和，操作簡(jiǎn)便且生產(chǎn)成本較低，是目前海藻糖制備的最佳選擇，國(guó)內(nèi)外多家企業(yè)已經(jīng)用于工業(yè)化海藻糖制備生產(chǎn)[10]的。圖 1-2 雙酶法制備海藻糖的?
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2661202