【摘要】：原始卵泡作為雌性生殖的基本功能單位,其儲備庫的建立具有兩個特點:一是幾乎所有哺乳動物原始卵泡的形成都是在妊娠中后期(如人)或出生前后(如小鼠)完成;二是大量的卵母細(xì)胞最終只能形成一定數(shù)量的原始卵泡。因此,原始卵泡庫是雌性哺乳動物不可再生的生殖資源,原始卵泡形成失敗或提早衰竭會引起卵巢早衰(Premature ovarian insufficiency,POI)。原始卵泡的形成是一個卵母細(xì)胞與體細(xì)胞互作的復(fù)雜生理過程,需要多種基因的時空性差異表達。其中,轉(zhuǎn)錄因子作為一類調(diào)控基因表達和決定細(xì)胞命運的關(guān)鍵分子,其在原始卵泡形成中的功能卻鮮有報道。本文我們研究了轉(zhuǎn)錄因子SP1在小鼠原始卵泡形成中的主要功能及作用機制。研究發(fā)現(xiàn),SP1在小鼠卵巢的卵母細(xì)胞及體細(xì)胞中均有表達,且表達水平伴隨原始卵泡的形成逐漸升高,并在原始卵泡形成完成后表達回落。為了明確SP1在原始卵泡形成中的作用,我們利用慢病毒敲降結(jié)合胚胎卵巢體外培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn),敲降Spl顯著抑制了小鼠原始卵泡的形成,同時卵母細(xì)胞的數(shù)量顯著增多。進一步利用胚胎卵巢體外重構(gòu)實驗表明,SP1主要在體細(xì)胞中發(fā)揮功能。為了探究SP1在體細(xì)胞中的作用,一方面我們利用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2(LGR5-KI)轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)合全卵巢敲降模型發(fā)現(xiàn),SP1缺失顯著抑制了前顆粒細(xì)胞從卵巢表面上皮LGR5陽性細(xì)胞的募集;另一方面利用FOXL2陽性細(xì)胞特異性敲降模型證明,SP1還調(diào)控了前顆粒細(xì)胞的維持。進一步的研究發(fā)現(xiàn),與全卵巢敲降Sp1的表型相一致,在前顆粒細(xì)胞中特異性敲降SS1顯著抑制了原始卵泡形成和卵母細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致大量卵母細(xì)胞以合胞體的形式存在于卵巢中。通過對SP1發(fā)揮功能的機制進一步研究證明,體細(xì)胞表達的Notch2介導(dǎo)了 SP1對前顆粒細(xì)胞發(fā)育及原始卵泡形成的調(diào)控。體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀及體外雙熒光素酶實驗結(jié)果表明,SP1可以直接與Notch2啟動子區(qū)結(jié)合進而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。為了探究由于SP1缺失導(dǎo)致的前顆粒細(xì)胞發(fā)育受阻是否會影響合胞體中卵母細(xì)胞的進一步發(fā)育,我們通過體外延長培養(yǎng)時間以及體內(nèi)腎被膜移植實驗發(fā)現(xiàn),在SP1缺失的卵巢中,卵泡和卵母細(xì)胞在青春期前發(fā)生了大規(guī)模丟失,導(dǎo)致POI的發(fā)生。同時,在Sp1被沉默的區(qū)域,Notch2和FOXL2的表達也出現(xiàn)同步化下調(diào),證明SP1調(diào)控的前顆粒細(xì)胞發(fā)育對于青春期前卵泡的存活也是至關(guān)重要的。綜上所述,我們的研究證明了 SP1作為一個控制顆粒細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,通過Notch2介導(dǎo)的信號通路調(diào)控了原始卵泡庫的建立與維持。這項研究為揭示體內(nèi)卵泡發(fā)育的機理奠定了理論基礎(chǔ);同時,對于促進輔助生殖醫(yī)學(xué)的進步,以及對于因卵泡發(fā)育問題而導(dǎo)致的POI等生殖疾病的預(yù)防和治療具有重要的理論指導(dǎo)意義。
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第一■章文獻綜述逡逑２００６）。研究表明原始卵泡的形成需要卵母細(xì)胞與體細(xì)胞在分裂和分化進程上保持高逡逑度一致，二者才能彼此互作形成原始卵泡（Ｌｅｉ邋ｅｔａｌ．，邋２００６）。圖１－１總結(jié)了小鼠原始卵逡逑泡形成過程中主要發(fā)育事件的時空分布情況。接下來，我們將對原始卵泡形成這一生逡逑理過程進行詳細(xì)介紹。逡逑Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ逡逑Ｇｅｒｍ邋Ｃｅｌｌｓ邐Ｇｅｒｍｌｉｎｅ邐Ｃｙｓｔ邐Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ邐Ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ逡逑ＡＲＭＩＮＧ邐ｃｙｓｔｂｒｅａｋｄｏｗｎ邋ｐＲ｜Ｍ0Ｒ0｜ＡＬ逡逑ＣＹＳＴＳ邐ＦＯＬＬＩＣＬＥＳ逡逑ＣＹＳＴＳ邐邐邐逡逑１１邐Ｉ：邐ｎ邐１４邐ＩＳ邐ｌｆｔ邋ｒ邐ＩＫ邋１９邐２０邐：ｌ邐：：邐２３邐：４邐：５邐ｄＰ°逡逑１邐Ｉ邐１邐Ｉ邐１邐ＩＩ邐ＩＩ邐Ｉ邐１邋Ｉ邐Ｉ邐１１逡逑＿邐７＂＾邐ｌ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑ｍｉｔｏｓｉｓ邐Ｉ邐：邐２邐３邐４邐ｓ邐６邐ＰＮＤ逡逑ａｒｒｉｖａｌ邐Ｏｏｃｙｔｅｓ邋Ｌ邋匕邋ｍｍ邋ｍｍ邋ｍ逡逑ａ，邋ｇｏｎａｄ邋Ｇｅｒｍ邋ｃｅｌｌｓ邐ｂｅｇｉｎ邐ｂｉｒｔｈ邋ｇｅｒｍ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅａｔｈ逡逑ｂｅｇｉｎ邋ｔｏ邐ｔｏ邐ａｒｒｅｓｔ逡逑ｅｎｔｅｒ邋ｍｅｉｏｓｉｓ邋ａｔ邋ｄ丨ｐ丨ｏｔｅｎｅ逡逑圖１－１原始卵泡形成中不同發(fā)育事件的時空分布圖（Ｐｅｐｌｉｎｇ，邋２００６）逡逑ＰＧＣｓ在１０．５邋ｄｐｃ左右到達生殖嵴，生殖細(xì)胞合胞體形成；１３．５邋ｄｐｃ時生殖細(xì)胞開始進入第一次減逡逑數(shù)分裂

分裂（Ｂｏｒｕｍ，邋１９６１；邋Ｃｏｎｔｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２；邋Ｓｌｉｚｙｎｓｋｉ，邋１９５７）。在此期間，卵母細(xì)胞會發(fā)生一逡逑系列如同源染色體聯(lián)會、ＤＮＡ重組、同源染色體分離而姐妹染色單體不分離等區(qū)別逡逑于有絲分裂的獨特事件。圖１－３即為各時期染色體的典型形態(tài)。逡逑Ａ．Ｌｅｐｔｏｔｅｎｅ邋Ｂ．Ｚｙｇｏｔｅｎｅ邋Ｃ．Ｐａｃｈｙｔｅｎｅ邋Ｄ．Ｄｉｐｌｏｔｅｎｅ邋Ｅ．邋Ｄｉｃｔｙａｔｅ逡逑ｉＨＱＨＳＤ逡逑圖１－３卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期各時期的染色體形態(tài)圖（Ｗａｎｇ邋ｅｔａｌ．，２０１５ａ）逡逑利用染色體鋪展與核型分析的方法展示卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期各時期的染色體形態(tài)，其中逡逑綠色為聯(lián)會復(fù)合體蛋白（Ｓｙｎａｐｔｏｎｅｍａｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋３，ＳＹＣＰ３）標(biāo)記染色體，藍色為Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑標(biāo)記細(xì)胞核。各個時期的定義如下：（Ａ）細(xì)線期（ｌｅｐｔｏｔｅｎｅ）－染色體表現(xiàn)為亂麻的線狀聚集；（Ｂ）偶逡逑線期（ｚｙｇｏｔｅｎｅ）－染色體變粗變短，出現(xiàn)聯(lián)會復(fù)合體結(jié)構(gòu)（Ｓｙｎａｐｔｏｎｅｍａｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，邋ＳＣ）；邋（Ｃ）粗線期逡逑（ｐａｃｈｙｔｅｎｅ）－完成染色體配對，染色體變得更粗更短；（Ｄ）雙線期（ｄｉｐｌｏｔｅｎｅ）－同源染色體分離；（Ｅ）逡逑核網(wǎng)期（ｄｉｃｔｙａｔｅ）－ＳＹＣＰ３從染色體上解離下來，染色體不再清晰可見，細(xì)胞核中能觀察到２－４個逡逑核小體。標(biāo)尺：ｌＯｐｉｕ逡逑研究表明，來源于中腎的視黃酸（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ邋ａｃｉｄ，ＲＡ）是生殖細(xì)胞啟動減數(shù)分裂的逡逑關(guān)鍵信號（Ｂｏｗｌｅｓ邋ｅｔ邋ａｌ．
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q492
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本文編號：2660622