【摘要】：棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)系已應(yīng)用于棉花雜交育種的生產(chǎn)實(shí)踐,但棉花CMS機(jī)理尚不清楚。之前研究發(fā)現(xiàn),哈克尼西棉CMS系線粒體基因組中存在一個(gè)特有的開(kāi)放閱讀框(ORF):orf160,該ORF在棉花CMS系中是轉(zhuǎn)錄的,但在棉花正�？捎抵形礄z測(cè)到該ORF的表達(dá),推測(cè)orf160可能與棉花CMS相關(guān)。但該ORF在蛋白水平表達(dá)情況如何尚不清楚,且缺乏相應(yīng)的研究用抗體,所以有必要制備出ORF160蛋白的抗體,為后續(xù)進(jìn)一步探究orf160在蛋白表達(dá)水平的差異、明確orf160與棉花CMS的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。本文對(duì)orf160基因進(jìn)行原核表達(dá)密碼子優(yōu)化,合成并分析,PCR擴(kuò)增并引入Rsr II和Not I限制性酶切位點(diǎn),雙酶切法構(gòu)建重組表達(dá)載體;利用E.Coli BL21(DE3)原核表達(dá)目的蛋白ORF160,確定表達(dá)形式,優(yōu)化表達(dá)條件,Ni~(2+)柱純化,抗His-tag抗體的Western Blot檢測(cè);以O(shè)RF160為抗原腹腔免疫Balb/C鼠制備鼠單抗,測(cè)定效價(jià),鑒定抗體特異性,初步建立檢測(cè)ORF160的雙抗體夾心法。結(jié)果表明目的基因orf160共480 bp,編碼159個(gè)氨基酸,將orf160雙酶切后連接表達(dá)載體pET-B2M,經(jīng)鑒定成功構(gòu)建重組表達(dá)載體orf160-pET-B2M。目的蛋白ORF160在E.Coli BL21(DE3)中表達(dá)為包涵體蛋白,符合預(yù)期蛋白分子量;0.1 mM的IPTG,30℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h為目的蛋白最佳表達(dá)條件,經(jīng)Ni~(2+)柱純化的蛋白濃度為1.1 mg/mL;Western Blot結(jié)果顯示ORF160與抗His-tag抗體特異性結(jié)合,說(shuō)明成功表達(dá)目的蛋白;以純化ORF160制備鼠單抗,共篩選出三株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株:2B9(6 400×)、2G10(6 400×)和3E9(3 200×);特異性實(shí)驗(yàn)表明,三種抗體對(duì)目的蛋白具有特異性,初步建立檢測(cè)ORF160的免疫學(xué)方法,檢測(cè)限不高于1.25μg/mL。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建原核表達(dá)載體orf160-pET-B2M,表達(dá)純化ORF160蛋白;成功制備出抗ORF160鼠單抗,初步建立能夠用于檢測(cè)ORF160的免疫學(xué)檢測(cè)方法。本研究為探究orf160與棉花CMS的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

蕓薹屬CMS-pol orf224/atp6CMS-ogrua orf138/atp8CMS-juncea orf108/atpA小 麥 CMS-T orf256/cox1向日葵 CMS-pet1 orf522/atpA水 稻CMS-BT orf79/atp6CMS-HL orfH79/atp6蘿 卜 CMS-kos orf125/atp8矮牽牛 CMS-S Pcf/nad3/rps12這些不育基因起初被認(rèn)為是未知功能的 ORF，它們來(lái)源于線粒體編碼 RNA[21]，，以嵌合序列的形式存在，這些不育基因與功能基因子水平影響線粒體的正常代謝途徑[23]，或者產(chǎn)生毒性蛋白[21]。植是龐大而復(fù)雜的，基因組時(shí)有突變、重排、核-質(zhì)互作的發(fā)生，都的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常代謝和生命活動(dòng)，包括和育性相關(guān)終導(dǎo)致植物育性喪失。

形的不良發(fā)育現(xiàn)象，這些研究足以證明該基因與棉花 CMS 具有相關(guān)性，將0 確定為棉花 CMS 相關(guān)基因。隨后，李楊等[41]也證實(shí)了這一點(diǎn)。外源基因的原核表達(dá)原核表達(dá)外源基因的常用系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)體系，因其在原核表達(dá)方面最研究和應(yīng)用，是原核表達(dá)外源蛋白的成熟菌種，優(yōu)點(diǎn)是菌種廉價(jià)易得，技術(shù)成熟，繁殖速度快，同時(shí)對(duì)多數(shù)外源蛋白具有耐受能力，蛋白表達(dá)效率高，大規(guī)模培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期短。近年來(lái)，已經(jīng)建立了多種用于高效表達(dá)外源蛋白統(tǒng)，主要在載體和宿主的選擇、目的基因的優(yōu)化上加以改進(jìn)。1 載體和宿主的選擇（1）表達(dá)載體的選擇：載體應(yīng)該包含用于克隆和表達(dá)外源基因的所有特定的元件，如圖 1.2。包括強(qiáng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、篩選標(biāo)記、純化標(biāo)簽等。
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)春理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 王繼s

本文編號(hào)：2660567