【摘要】：作為Homeobox家族中的一員,HOXC10在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中起著重要的作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明HOXC10在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有調(diào)節(jié)作用,但關(guān)于HOXC10基因自身的表達(dá)調(diào)節(jié)相對(duì)被忽略。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在HOXC10啟動(dòng)子的反義鏈上存在多個(gè)連續(xù)的鳥(niǎo)嘌呤序列,并且利用G-四鏈體預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)每個(gè)多鳥(niǎo)嘌呤序列之間具有較高的形成G-quadreplex(G-四鏈體)結(jié)構(gòu)的潛力。針對(duì)有高潛力形成G-四鏈體的區(qū)域利用化學(xué)合成方法體外合成該區(qū)域?qū)?yīng)的寡核苷酸單鏈,通過(guò)圓二色譜實(shí)驗(yàn)分析并確定該區(qū)域存在的多個(gè)連續(xù)的鳥(niǎo)嘌呤序列在特定的波長(zhǎng)處呈現(xiàn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)所展現(xiàn)的特定摩爾橢圓率,明確了 HOXC10啟動(dòng)子區(qū)域存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳展示該區(qū)域在一定濃度的氯化鉀溶液中能夠形成分子內(nèi)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。將寡核苷酸單鏈用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入人的宮頸癌HeLa細(xì)胞中,用G-四鏈體的抗體BG4做免疫熒光檢測(cè)到熒光信號(hào),證實(shí)寡核苷酸單鏈在癌細(xì)胞自身內(nèi)環(huán)境中也可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。將HOXC10轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp的核苷酸序列通過(guò)PCR方法克隆到高斯熒光素酶報(bào)告載體中,并將能夠形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變,將不同的報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,利用發(fā)光底物檢測(cè)高斯熒光素酶表達(dá)情況。結(jié)果顯示G-四鏈體結(jié)構(gòu)缺失或突變能夠改變HOXC10啟動(dòng)子下游的高斯螢光素酶表達(dá)。據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)記載,G-四鏈體結(jié)構(gòu)的打開(kāi)需要解旋酶的調(diào)控,本研究分析了759個(gè)乳腺癌病人樣本,發(fā)現(xiàn)具有DNA解旋酶活性的染色質(zhì)重塑蛋白CHD7與HOXC10基因的表達(dá)呈正相關(guān),通過(guò)熒光素酶報(bào)告載體及CHD7表達(dá)干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解旋酶CHD7能夠解開(kāi)HOXC10啟動(dòng)子中的G-四鏈體結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)其基因表達(dá)。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,HOXC10啟動(dòng)子的G-rich區(qū)域能夠形成G-四鏈體結(jié)構(gòu),并且能夠被解旋酶CHD7解旋進(jìn)而調(diào)控HOXC10基因表達(dá)。
【圖文】：

逑三個(gè)以上的分子內(nèi)或分子間的平面四鏈體，每個(gè)平面的鳥(niǎo)嘌呤之間通過(guò)Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氫鍵穩(wěn)定逡逑其結(jié)構(gòu)［１７］，其中相鄰鳥(niǎo)嘌呤之間相對(duì)大約旋轉(zhuǎn)９０°邋（圖１）邋［｜８］，中間位置為金屬陽(yáng)離子，四逡逑周的４個(gè)鳥(niǎo)嘌呤之間通過(guò)Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氫鍵連接。一些金屬陽(yáng)離子緩沖溶液能夠穩(wěn)定Ｇ－四鏈逡逑體結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性順序?yàn)椋耍荆危幔荆危龋矗荆蹋椋簦欤梗�。目前研宄者提出多種不同的算法來(lái)預(yù)測(cè)候逡逑選序列形成Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)的潛能［２（Ｗ３］。在各種生化技術(shù)如圓二色譜、ＮＭＲ光譜、非變性聚逡逑丙烯酰胺凝膠電泳等的幫助下，通過(guò)化學(xué)合成方法將內(nèi)源性啟動(dòng)子的鳥(niǎo)嘌呤富集區(qū)合成寡核逡逑苷酸單鏈，證明了邋Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)可以在體外形成［１７］。逡逑丫＇逡逑）—（／ｈ逡逑ｙＷＨ逡逑Ｈ逡逑圖１邋Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)平面圖逡逑中間位置為金屬陽(yáng)離子，四周的４個(gè)鳥(niǎo)嘌呤之間通過(guò)Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氫鍵連接。逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ逡逑Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅｔａｌ邋ｃａｔｉｏｎ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｆｏｕｒ邋ｇｕａｎｉｎｅｓ邋ａｒｏｕｎｄ邋ｉｔ邋ａｒｅ邋ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ逡逑ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｂｏｎｄ．逡逑１．２．１邋Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)的功能逡逑研宄發(fā)現(xiàn)，Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)廣泛分布于釀酒酵母細(xì)胞中和人類基因組上，尤其是在哺乳逡逑動(dòng)物中許多基因的Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)區(qū)域是進(jìn)化保守的［２４￣２６］。并且大數(shù)據(jù)運(yùn)算發(fā)現(xiàn)，，在人類基逡逑因組上存在的潛在Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)形成位點(diǎn)超過(guò)３０萬(wàn)個(gè)［２５］。這些潛在的Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)在調(diào)逡逑控的關(guān)鍵位點(diǎn)分布較多

在基因的啟動(dòng)子區(qū)域中，Ｇ－四鏈體結(jié)構(gòu)可以在其正義鏈或負(fù)義鏈中形成。本研宄檢測(cè)逡逑了人類ＨＯＸＣ１０基因的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在ＨＯＸＣ１０基因臨近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域逡逑存在胞嘧啶富集區(qū)，見(jiàn)圖３－１，胞嘧啶富集區(qū)域?yàn)榧t色部分，而其互補(bǔ)鏈就正好存在著（Ｇ＞逡逑ｓＮ＾ＧｇＮ＾Ｇ＾Ｎ＾Ｇ＾）。將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的第一個(gè)核苷酸定義為“－１”時(shí)，在－２９５和－逡逑２７２之間存在著連續(xù)４組５個(gè)胞嚼啶連續(xù)出現(xiàn)的情況，而其反向互補(bǔ)鏈則存在著連續(xù)４組５逡逑個(gè)鳥(niǎo)嘌呤連續(xù)出現(xiàn)的情況
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q75

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本文編號(hào)：2659455