【摘要】：棉花是世界上最重要的纖維作物,棉花生產(chǎn)與農(nóng)業(yè)、手工業(yè)、貿(mào)易業(yè)等多個(gè)行業(yè)的發(fā)展關(guān)系十分密切,棉纖維的品質(zhì)決定了棉花的商業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。探討棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)和次生壁合成的分子調(diào)控機(jī)理,對(duì)提高棉纖維品質(zhì)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中鑒定了 5個(gè)LIM蛋白家族基因,獲得GhWLIM5和GhXLIM6轉(zhuǎn)基因棉花植株及其后代株系,本文主要對(duì)其中兩個(gè)LIM蛋白在轉(zhuǎn)基因棉花后代株系纖維發(fā)育中的功能及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了較為深入的探討。此外,還對(duì)一個(gè)在棉纖維細(xì)胞次生壁發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行了初步分析,構(gòu)建載體,轉(zhuǎn)化棉花,獲得該MYB基因的轉(zhuǎn)基因棉花株系。本文獲得的主要研究結(jié)果如下:1、抑制Gh WLIM5/GhXLIM6的表達(dá)阻礙棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育為研究LIM蛋白在棉纖維發(fā)育中的功能,分析了GhWLIM 和GhXLIM6 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花后代株系的纖維長(zhǎng)度變化等遺傳表型。我們測(cè)量了不同RNAi棉花后代株系成熟棉纖維長(zhǎng)度,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因棉花成熟棉纖維長(zhǎng)度都不同程度變短。進(jìn)一步通過(guò)離體培養(yǎng)胚珠,測(cè)量發(fā)育中的棉纖維細(xì)胞長(zhǎng)度,發(fā)現(xiàn)在纖維快速伸長(zhǎng)期,轉(zhuǎn)基因棉花纖維生長(zhǎng)速度明顯慢于野生型。上述結(jié)果說(shuō)明GhWLIM5和GhXLIM6可能在棉纖維伸長(zhǎng)階段發(fā)揮正調(diào)控作用。2、GhWLIM5和GhXLIM6作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白促進(jìn)棉纖維中肌動(dòng)蛋白(F-actin)聚集成束在棉纖維發(fā)育過(guò)程中,F-actin維持一定聚合程度是必需的。用LatB(F-actin解聚劑)處理野生型棉花胚珠,導(dǎo)致棉纖維發(fā)育受阻。用Atto 488-鬼筆環(huán)肽對(duì)處于快速伸長(zhǎng)期的棉纖維中F-actin進(jìn)行染色觀察,結(jié)果顯示,與野生型棉纖維相比,GhWLIM5和GhXLIM6 RNAi轉(zhuǎn)基因植株棉纖維中,肌動(dòng)蛋白絲束更細(xì),定量分析結(jié)果也顯示,這些轉(zhuǎn)基因棉纖維中F-actin聚合度更低。這些結(jié)果說(shuō)明GhWLIM5和GhXLIM6都能夠作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,促進(jìn)棉纖維細(xì)胞中F-actin絲束的形成,從而影響棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育。3、GhWLIM5和GhXLIM6與F-actin結(jié)合能力以及促進(jìn)F-actin聚合能力存在差異研究表明,不同LIM蛋白對(duì)F-actin的結(jié)合能力,以及促進(jìn)F-actin的聚合能力可能存在差異。本文首先通過(guò)定量高速共沉淀實(shí)驗(yàn),對(duì)GhWLIM5和GhXLIM6蛋白與F-actin的結(jié)合能力進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示,在加入同樣濃度的F-actin的情況下,GhXLIM6在沉淀中的比例更高,而GhWLIM5的沉淀量明顯低于前者,這表明GhXLIM6與F-actin的結(jié)合能力更強(qiáng)。隨后,采用低速共沉淀實(shí)驗(yàn)比較分析GhWLIM5和GhXLIM6促進(jìn)F-actin聚合的能力,結(jié)果顯示添加2μM GhXLIM6即可使70%低聚合度的F-actin聚合成高聚合度的F-actin絲束,而達(dá)到同樣效果,GhWLIM5需要添加4μM,這說(shuō)明GhXLIM6促進(jìn)F-actin聚合的能力強(qiáng)于GhWLIM5。4、pH值對(duì)LIM蛋白促進(jìn)F-actin聚合的影響研究表明,一些LIM蛋白促進(jìn)F-actin聚合會(huì)受到pH值的影響。利用低速共沉淀實(shí)驗(yàn),比較了在不同pH環(huán)境下上述兩個(gè)LIM蛋白促進(jìn)F-actin聚合的能力。結(jié)果顯示,加入同樣濃度的GhWLIM5,隨著pH值下降,處于沉淀中的F-actin 比例不斷上升,表明GhWLIM5促進(jìn)F-actin的聚合受到pH值的影響,pH值越低,促聚合能力越強(qiáng)。相反,實(shí)驗(yàn)表明pH值的改變不影響GhXLIM6促進(jìn)F-actin聚合的能力。5、棉花遺傳轉(zhuǎn)化及GhMYBL1轉(zhuǎn)基因棉花植株的鑒定分離鑒定了一個(gè)在棉纖維細(xì)胞次生壁發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因,命名為GhMYBL1。構(gòu)建了GhMYBL1過(guò)量表達(dá)和RNAi載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化,獲得GhMYBL1過(guò)量表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株,并對(duì)T0代棉花苗進(jìn)行了陽(yáng)性鑒定。共獲得了30個(gè)株系65棵陽(yáng)性苗,移栽到大田或溫室,進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育至成熟。有關(guān)GhMYBL1轉(zhuǎn)基因棉花株系的遺傳表型等方面的分析,正在進(jìn)行中。6、GhMYBL1蛋白重組表達(dá)和多克隆抗體制備構(gòu)建了pET28a-GhMYBL1的原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)GhMYBL1蛋白,通過(guò)免疫家兔獲取GhMYBL1多克隆抗體,Western Blot對(duì)抗體的特異性及效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè),表明該抗體可以用于后續(xù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。
【圖文】：

。，目前全球廣泛種植的是陸地棉Ｗｒｓ＇ｗ／ｗｗｊ）和海島棉逡逑ｒ如在我國(guó)多地也被廣泛種植。棉花生產(chǎn)與人類生活息息相關(guān)，只良的品種才能保證棉花的種植增產(chǎn)和增收。全球有超過(guò)８０多個(gè)國(guó)家種植１５０多個(gè)國(guó)家參與棉花的進(jìn)口與出口（Ｌｅｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７），可見棉花與人類的關(guān)。逡逑１．１．１棉花纖維發(fā)育過(guò)程逡逑纖維品質(zhì)是棉花重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)和育種目標(biāo)，育種人員一直以來(lái)都很期且質(zhì)地優(yōu)良的棉纖維。隨著遺傳、農(nóng)業(yè)、分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)的不斷發(fā)從基因、蛋白、表觀修飾等層次研究棉花纖維發(fā)育的機(jī)制。棉花纖維由層的單細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)，是世界上最長(zhǎng)的細(xì)胞，長(zhǎng)度可達(dá)到３ｃｍ甚至長(zhǎng)絨和短絨，獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)決定了棉花是研宄細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁、纖模式系統(tǒng)（Ｋｉｍ邋ｅｔａｌ．，邋２００１）。棉纖維發(fā)育過(guò)程分為四個(gè)不同但相互重疊的起始、纖維伸長(zhǎng)、次生細(xì)胞壁（ＳＣＷ）生物合成和增厚期以及棉花脫水ｍ邋ａｎｄ邋ＴｒｉＰｌｅｔ，邋２００１邋；Ｌｅｅ邋ｅｔａｌ．，２００７）（圖邋１．１）。逡逑

植物激素如生長(zhǎng)素、赤霉素（ＧＡ）、細(xì)胞分裂素、油菜素類固醇（ＢＲ）、脫落酸逡逑（ＡＢＡ）、乙烯、茉莉酸（ＪＡ）等是內(nèi)源性的小分子激素，許多激素已經(jīng)被證明直接參逡逑與植物生長(zhǎng)，細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞膨脹（ＤａｖｉＳｒｅａｎｄＡｃｈａｒｄ，２０１６），圖１．２。逡逑生長(zhǎng)素在開花前開始積累，在２－３邋ＤＰＡ達(dá)到高峰，在１０邋ＤＰＡ左右逐漸下降到逡逑初始水平（Ｃｈｅｎ邋ａｎｄ邋Ｇｕａｎ，邋２０１１）。在邋Ｆ５Ｐ７（Ｆｌｏｒａｌ邋Ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋７）基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)逡逑下表達(dá)ＩＡＡ合成的基因ｋａＭ，發(fā)現(xiàn)棉花胚珠表皮纖維突起顯著增多，最終導(dǎo)致棉逡逑纖維產(chǎn)量增加１５％（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１１）。纖維細(xì)胞中生長(zhǎng)素的流動(dòng)和胚珠表皮細(xì)胞中逡逑激素梯度的建立主要由ＧｈＰＩＮ３ａ蛋白介導(dǎo)的，，ＧＡｉＶＡ／如基因在開花當(dāng)天的胚珠外層逡逑細(xì)胞中有高效表達(dá)，抑制多種胚珠特異性基因可以顯著抑制纖維細(xì)胞的形成逡逑和伸長(zhǎng)（Ｚｈａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１６）。Ｇｏｕ等發(fā)現(xiàn)５個(gè)生長(zhǎng)素基因在棉纖維伸長(zhǎng)期（６－１２ＤＰＡ）逡逑高度表達(dá)（Ｇｏｕ邋ｅｔ邋ａｌ．
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S562;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2659534