【摘要】：嗜熱菌,是一類能適應(yīng)高溫的微生物。其生長速度較快,代謝較強,在高溫下有著顯著的生存優(yōu)勢,在環(huán)境保護、能源利用等方面具有廣泛的應(yīng)用。嗜熱酶,是從嗜熱菌中分離得到,能夠適應(yīng)高溫反應(yīng)條件的酶。酶偶聯(lián)法是體外測定酶活性的常用方法之一。如:丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是測定核苷二磷酸(nucleoside diphosphate,NDP)生成反應(yīng)的常用偶聯(lián)酶。嗜熱菌蒼白空氣芽孢桿菌(Aeribacillus pallidus JH-7)的最適生長溫度為50℃。為了分析其PK和LDH是否可以作為50℃反應(yīng)條件的偶聯(lián)酶,本研究從A.pallidus JH-7基因組中克隆其pk和ldh,分別構(gòu)建入表達載體pET24a,經(jīng)蛋白質(zhì)的誘導表達、純化得純度達95%以上的apPK和apLDH。利用分光光度法,分別對apLDH和apPK的催化效率和動力學常數(shù)及進行了探討,我們發(fā)現(xiàn)apPK的最適底物為ADP,其催化效率是5×10~4M~(-1.)s~(-1),最適pH為8.0,最適溫度為45℃;NADH為apLDH的最適底物,催化效率為3.7×10~5 M~(-1·)s~(-1),最適pH為5.8,最適溫度為35℃。雖然50℃不是apLDH和apPK的最適溫度,但它們在此溫度下k_(cat)分別為16.4 s~(-1)和64.5 s~(-1),暗示它們可以作為此溫度下的偶聯(lián)酶。TFSAC(Thermobifida fusca,嗜熱放線菌;硫酸鹽復合體)是嗜熱放線菌的硫酸鹽活化酶復合體,其缺失了ATP硫酸化酶的活性,但是具有腺苷磷酰硫酸激酶(adenosine 5'-phosposulfate kinase,APSK)的活性。APSK在硫的同化代謝中具有不可替代的功能。利用apLDH和apPK作為偶聯(lián)酶,分析了其在50℃的反應(yīng)條件下,其底物ATP和APS的動力學常數(shù)。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)K_(mAPS)為0.65μM,k_(cat)值為4.6 s~(-1)。而在25℃的反應(yīng)條件下,其K_(mAPS)為0.56μM、k_(cat)為2.45s~(-1)。所以在50℃的反應(yīng)條件下,TFSAC酶APSK的k_(cat)值是25℃反應(yīng)條件下的1.9倍,K_(mAPS)值是25℃反應(yīng)條件下的1.1倍,其APSK活性在50℃和25℃的活性相差不大,也說明apLDH和apPK可以作為偶聯(lián)酶應(yīng)用于NDP的測定。
【圖文】：

appk的擴增圖

apldh的擴增圖
【學位授予單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q936

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周小鷺;嗜熱菌及其嗜熱機制[J];林業(yè)科技情報;1996年03期

2 王學敏;唐海倫;;嗜熱菌的生理[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1985年02期

3 朱雪梅;宋家興;;嗜熱菌——人類疾病的一種新病因[J];衡陽醫(yī)學院學報;1987年04期

4 ;應(yīng)用嗜熱菌控制垃圾蠅蛆初報[J];醫(yī)學動物防制;1988年03期

5 馬挺,劉如林;嗜熱菌耐熱機理的研究進展[J];微生物學通報;2002年02期

6 林禹欣;劉惠麟;韓葳葳;詹冬玲;劉景圣;;嗜熱菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965磷酸三酯酶的原核表達、純化及性質(zhì)表征[J];吉林大學學報(理學版);2013年06期

7 張輝,胡志,尹荻,楊保剛;原料奶中嗜熱菌的來源與控制措施[J];中國奶牛;2004年01期

8 李鶴賓;王怡倩;;嗜熱嗜熱菌超氧化物歧化酶的克隆、表達與鑒定[J];臺灣海峽;2007年04期

9 李壽朋;王瑞;郭玉婷;郭玉潔;王國華;劉新星;邱冠周;;中等嗜熱菌群協(xié)同脫除高硫鋁土礦中的硫[J];中國有色金屬學報;2016年11期

10 李啊林;黃松濤;溫建康;武彪;李曉暉;;中等嗜熱菌浸出德興黃銅礦的試驗研究[J];金屬礦山;2011年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 蘇龍;韋宇拓;黃日波;;嗜熱菌的分離與鑒定[A];廣西微生物學會2003年學術(shù)年會論文集[C];2003年

2 徐聰聰;陳潔梅;常磊;劉永萍;;嗜熱微生物的研究進展[A];第八屆中國酶工程學術(shù)研討會論文集[C];2011年

3 汪浩;李宇馳;陳曄;洪星;段舉;李濤;王敬強;殷劍寧;劉斯奇;;騰沖嗜熱菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(TPB)的開發(fā)與利用[A];中國蛋白質(zhì)組學首屆學術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

4 祝偉;察冬梅;程古月;彭謙;沈萍;;嗜熱菌株YMTC1049的分類鑒定及其產(chǎn)生的高溫蛋白酶的分離純化和酶學性質(zhì)[A];第二屆中國青年學者微生物遺傳學學術(shù)研討會論文集[C];2006年

5 蔣濤;蔡孟浩;周祥山;張元興;;深海嗜熱菌發(fā)酵生產(chǎn)熱穩(wěn)定淀粉酶及相關(guān)基因的異源表達[A];全國第九屆海洋生物技術(shù)與創(chuàng)新藥物學術(shù)會議論文摘要集[C];2014年

6 唐群;高璞;高昂;劉順;閆小雪;梁棟材;;騰沖嗜熱菌重組修復蛋白ttRecR的X-射線初步晶體學研究[A];第十一次中國生物物理學術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

7 施亮;梁棟材;;來自嗜熱菌Thermoanaerobacter tengcongensis的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶的重組表達和晶體生長[A];第十次中國生物物理學術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

8 林暉;李聰穎;孟春;郭養(yǎng)浩;;嗜酸嗜熱菌FDCU對黃銅礦的生物氧化作用[A];第一屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

9 梁利華;闞振榮;;嗜熱菌及嗜熱酶的研究應(yīng)用[A];微生物生態(tài)學研究進展——第五屆微生物生態(tài)學術(shù)研討會論文集[C];2003年

10 胡先望;陳朋;王雄;嚴曉娟;梁寧;;一種嗜熱菌的α-葡萄糖苷酶純化及性質(zhì)研究[A];第三屆全國微生物資源學術(shù)暨國家微生物資源平臺運行服務(wù)研討會會議論文摘要集[C];2011年

相關(guān)博士學位論文 前9條

1 丁彥蕊;嗜熱菌耐熱性與蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的生物信息學研究[D];江南大學;2005年

2 劉斌;高溫噬菌體分子特征及熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶的性質(zhì)[D];福建農(nóng)林大學;2007年

3 彭婷婷;新嗜熱菌Thermoanarobacter sp.YS13基因組序列以及生長和發(fā)酵性質(zhì)的分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

4 楊春雪;嗜熱菌強化剩余污泥水解及短鏈脂肪酸積累規(guī)律研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2015年

5 賈憲波;福州溫泉嗜熱菌多樣性及嗜熱菌Geobacillus thermoglucosidasius低溫適應(yīng)的機制[D];福建農(nóng)林大學;2016年

6 張心齊;陸地熱泉及深海熱液沉積物生境中的嗜熱菌多樣性研究[D];浙江大學;2009年

7 劉月芹;釀酒酵母耐熱分子調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用[D];天津大學;2014年

8 魏大海;深海熱液區(qū)嗜熱菌噬菌體GVE2與宿主相互作用的分子機理研究[D];廈門大學;2008年

9 鄔長斌;中等嗜熱菌浸出黃銅礦的研究[D];中南大學;2010年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 王文珍;嗜熱菌丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的原核表達、純化及活性分析[D];浙江師范大學;2019年

2 林謙;超嗜熱菌Pyrococcus furiosus的培養(yǎng)及其α-淀粉酶基因的克隆與表達[D];廣西大學;2003年

3 張瓏;中等嗜熱菌群浸提鋅冶煉渣的基本特性及其浸出條件研究[D];中南大學;2011年

4 王艷平;長白山溫泉嗜熱菌的分離培養(yǎng)及多相分類學研究[D];吉林大學;2007年

5 黎婷婷;中度嗜熱菌中PprI同源蛋白DG0395的研究[D];浙江大學;2015年

6 董瑞強;一株嗜熱菌代謝產(chǎn)物增強鯉魚免疫力活性成分的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2010年

7 阮靈偉;嗜熱菌分子分類方法及適應(yīng)性機制的初步研究[D];廈門大學;2006年

8 林禹欣;嗜熱菌磷酸三酯酶的異源表達及性質(zhì)表征[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2013年

9 劉俊;Thermus Thermophilus HB27蘋果酸脫氫酶基因的克隆表達、酶抑制動力學及蛋白折疊研究[D];浙江理工大學;2010年

10 余霖霖;α-半乳糖苷酶基因及酸性磷酸酶基因的克隆與表達研究[D];蘇州大學;2007年

，

本文編號：2658735