【摘要】：嗜熱菌,是一類能適應高溫的微生物。其生長速度較快,代謝較強,在高溫下有著顯著的生存優(yōu)勢,在環(huán)境保護、能源利用等方面具有廣泛的應用。嗜熱酶,是從嗜熱菌中分離得到,能夠適應高溫反應條件的酶。酶偶聯(lián)法是體外測定酶活性的常用方法之一。如:丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是測定核苷二磷酸(nucleoside diphosphate,NDP)生成反應的常用偶聯(lián)酶。嗜熱菌蒼白空氣芽孢桿菌(Aeribacillus pallidus JH-7)的最適生長溫度為50℃。為了分析其PK和LDH是否可以作為50℃反應條件的偶聯(lián)酶,本研究從A.pallidus JH-7基因組中克隆其pk和ldh,分別構(gòu)建入表達載體pET24a,經(jīng)蛋白質(zhì)的誘導表達、純化得純度達95%以上的apPK和apLDH。利用分光光度法,分別對apLDH和apPK的催化效率和動力學常數(shù)及進行了探討,我們發(fā)現(xiàn)apPK的最適底物為ADP,其催化效率是5×10~4M~(-1.)s~(-1),最適pH為8.0,最適溫度為45℃;NADH為apLDH的最適底物,催化效率為3.7×10~5 M~(-1·)s~(-1),最適pH為5.8,最適溫度為35℃。雖然50℃不是apLDH和apPK的最適溫度,但它們在此溫度下k_(cat)分別為16.4 s~(-1)和64.5 s~(-1),暗示它們可以作為此溫度下的偶聯(lián)酶。TFSAC(Thermobifida fusca,嗜熱放線菌;硫酸鹽復合體)是嗜熱放線菌的硫酸鹽活化酶復合體,其缺失了ATP硫酸化酶的活性,但是具有腺苷磷酰硫酸激酶(adenosine 5'-phosposulfate kinase,APSK)的活性。APSK在硫的同化代謝中具有不可替代的功能。利用apLDH和apPK作為偶聯(lián)酶,分析了其在50℃的反應條件下,其底物ATP和APS的動力學常數(shù)。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)K_(mAPS)為0.65μM,k_(cat)值為4.6 s~(-1)。而在25℃的反應條件下,其K_(mAPS)為0.56μM、k_(cat)為2.45s~(-1)。所以在50℃的反應條件下,TFSAC酶APSK的k_(cat)值是25℃反應條件下的1.9倍,K_(mAPS)值是25℃反應條件下的1.1倍,其APSK活性在50℃和25℃的活性相差不大,也說明apLDH和apPK可以作為偶聯(lián)酶應用于NDP的測定。
【圖文】：

appk的擴增圖

apldh的擴增圖
【學位授予單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q936

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