【摘要】：明黨參是我國傘形科的單種屬珍稀植物,屬于國家三級重點(diǎn)保護(hù)植物。本文旨在對珍稀中草藥明黨參的微生物種群基因庫進(jìn)行探索,發(fā)掘明黨參微生物種群的生物功能,篩選出可拮抗致病菌的內(nèi)生菌株,以及能高效降解廣泛使用的磺酰脲類除草劑——苯磺隆的降解菌,并研究明黨參內(nèi)生菌對其三種呋喃香豆素成分的生物轉(zhuǎn)化作用。研究結(jié)果表明:(1)本實(shí)驗(yàn)經(jīng)三步消毒法和平板培養(yǎng)法,從新鮮的明黨參植株的根、莖、葉中分離篩選出29株內(nèi)生細(xì)菌和18株內(nèi)生真菌。在不同組織中明黨參植株的內(nèi)生菌株數(shù)量存在一定的差異,菌株數(shù)量根中最多,莖中最少。經(jīng)過培養(yǎng)特征、形態(tài)學(xué)鑒定、生化特性、16S r DNA基因序列分析、遺傳圖譜分析和全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測等手段,發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌中芽孢桿菌屬居多。(2)利用混菌法,經(jīng)過試驗(yàn)的初篩,明黨參內(nèi)生細(xì)菌有5株菌對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較好的抑菌性。通過復(fù)篩,其中菌株NMG5對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑可達(dá)28.5mm,菌株NMJ10的抑菌圈直徑值為20.30mm,表明其具有相對較強(qiáng)的抑菌作用,且菌株NMJ10具有廣譜抑菌作用。根據(jù)生物學(xué)鑒定,菌株NMJ10為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.NMJ10),菌株NMG5為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa NMG5)。(3)為了解決苯磺隆的殘留問題,本實(shí)驗(yàn)篩選出能夠高效降解苯磺隆的菌株,以期制成降解率更高的復(fù)合菌劑。采用富集馴化培養(yǎng)分離法,篩出多株能降解苯磺隆的菌株,通過復(fù)篩得到菌株P(guān)MG3和NMY4能夠高效降解磺酰脲類除草劑苯磺隆。經(jīng)過菌株降解之后,第1天時(shí)降解效率最高,在第三天時(shí)降解率可以達(dá)到89%以上。其中經(jīng)過3天降解,菌株P(guān)MG3降解苯磺隆的降解率可以達(dá)到89.01%-90.39%,菌株NMY4的降解率為88.97%-89.13%。根據(jù)生物學(xué)鑒定,菌株P(guān)MG3為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.PMG3)。(4)為了探究明黨參內(nèi)生菌對其三種呋喃香豆素成分的生物轉(zhuǎn)化作用,本文通過HPLC法測定明黨參原粉培養(yǎng)液經(jīng)明黨參內(nèi)生菌發(fā)酵后歐前胡素、異歐前胡素、補(bǔ)骨脂素三種呋喃香豆素成分的含量。隨著菌株轉(zhuǎn)化,明黨參原液經(jīng)明黨參內(nèi)生菌發(fā)酵后,提高了呋喃香豆素成分歐前胡素、異歐前胡素和補(bǔ)骨脂素的含量,代謝產(chǎn)物主要集中在發(fā)酵液的上清液中。明黨參培養(yǎng)液的發(fā)酵過程中,經(jīng)菌株NMG10發(fā)酵后,歐前胡素、異歐前胡素和補(bǔ)骨脂素的增加比例依次為97.72%、2.38%和4.62%,相對的呋喃香豆素總量增加39.60%。通過一系列實(shí)驗(yàn),可以看出菌株NMG10對三種呋喃香豆素類成分的轉(zhuǎn)化作用最佳,菌株在整個(gè)發(fā)酵過程中對歐前胡素這一成分的含量有顯著的提高作用,可證明更有利于歐前胡素成分的轉(zhuǎn)化合成。根據(jù)生物學(xué)鑒定,菌株NMG10為假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)。
【圖文】：

2 明黨參內(nèi)生菌的分離純化與鑒定94℃ 4min 預(yù)變性94℃ 45 sec55 ℃ 45 sec30 cycle72℃ 1 min72℃ 10 min 修復(fù)延伸4℃ ∞ 終止反應(yīng)2.3 凝膠電泳 1%瓊脂糖下電泳，，設(shè)置 150 V ，100 mA ，20 min 電泳觀察。表 2.11 PCR 循環(huán)條件Tab2.11 PCR cycle conditions溫度 時(shí)間 程序

圖 2.3.1 明黨參各組織內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)Figure 2.3.1 Morphology of endophytic bacteria in various tissues of Changium smyrnioidesWolff（注：A 明黨參根組織的菌落形態(tài) B 明黨參莖組織的菌落形態(tài) C 明黨參葉組織切塊的菌落形態(tài)）表 2.3.1 明黨參內(nèi)生細(xì)菌編號及菌落形態(tài)學(xué)觀察Table 2.3.1 The numbering of endogenous bacteria of Changium smyrnioides Wolff andmorphological observation of the colony菌株編號菌落形態(tài)顏色大小形狀 邊緣狀況干燥或濕潤來源NMG3 綠色微小圓形 整齊 濕潤 根NMG5 綠色 小 不規(guī)則 不整齊 濕潤 根NMG6 黃綠色微小圓形 整齊 濕潤 根
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.53;Q93

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本文編號：2657274