【摘要】：第一章利用CRISPR/Cas9技術(shù)在HepG2和293T細(xì)胞內(nèi)敲除LMNA基因目的:利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的293T與HepG2細(xì)胞株的LMNA(Lamin A,A型核纖層蛋白)基因進(jìn)行編輯,獲得LMNA基因敲除細(xì)胞系,并觀察細(xì)胞核膜變化以及整體細(xì)胞形態(tài)的變化。方法:利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)293T細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞的LMNA基因進(jìn)行編輯,然后進(jìn)行嘌呤霉素篩選,單克隆挑取,DNA測(cè)序和western blot鑒定,對(duì)獲取的LMNA雙等位基因敲除細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)增與保存。利用掃描電鏡和透射電鏡對(duì)LMNA敲除(LMNA KO)以及野生型(WT)細(xì)胞的形態(tài)與核膜形態(tài)進(jìn)行觀察,同時(shí)利用免疫熒光技術(shù)對(duì)LMNA敲除細(xì)胞核膜與細(xì)胞骨架進(jìn)行觀察。結(jié)果:DNA測(cè)序結(jié)果顯示293T與HepG2單克隆細(xì)胞均有堿基缺失,蛋白免疫印跡結(jié)果顯示Lamin A/C不表達(dá),成功獲得兩株LMNA基因敲除細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)后,293T細(xì)胞的LMNA基因敲除后,與野生型比較其胞體變小變圓,突出連接減少并變細(xì);HepG2細(xì)胞的LMNA基因敲除后,與野生型比較其細(xì)胞變成多邊形,胞質(zhì)較為均勻的分布在核周。透射電鏡發(fā)現(xiàn)LMNA基因敲除后,細(xì)胞核膜失去光滑,變得凹凸不平。結(jié)論:Lamin A/C的缺失會(huì)導(dǎo)致體外培養(yǎng)細(xì)胞的核膜變形,進(jìn)一步導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞形態(tài)的改變。第二章敲除LMNA基因?qū)epG2和293T細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成能力與體內(nèi)致瘤性的影響目的:比較293T與HepG2細(xì)胞LMNA基因敲除細(xì)胞株(LMNA KO)和野生型細(xì)胞系(WT)的細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成能力以及體外與體內(nèi)的致瘤性,研究LMNA基因缺失對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,并探索相關(guān)分子機(jī)制。方法:1)將293T與HepG2細(xì)胞分為WT組和LMNA KO組,利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期。LMNA KO細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)LMNA,Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK1與Cyclin B1,DNA損傷標(biāo)志物γ-H2A.X,抑癌基因RB和P16的表達(dá)量以及組蛋白表觀遺傳修飾情況(H3K9me3、H3K27me3)。2)通過(guò)細(xì)胞劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)WT與LMNA KO細(xì)胞的遷移與穿孔能力進(jìn)行檢測(cè),并通過(guò)western blot檢測(cè)MMP2,MMP9,COL1A1與integrinβ4的表達(dá)量。3)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn):6孔板每孔每種加入3000個(gè)細(xì)胞,4周后測(cè)量克隆體直徑與數(shù)量;平板克隆形成實(shí)驗(yàn):六孔板每孔加入1000細(xì)胞,2周后計(jì)數(shù)克隆體數(shù)量。4)裸鼠體內(nèi)致瘤性實(shí)驗(yàn):將24只4周齡雌性裸鼠隨機(jī)分為4組(n=6),分別注射293T,HepG2,293T-LMNA KO與HepG2-LMNA KO四種細(xì)胞(每只裸鼠前肢兩側(cè)腋下各注射2x10~6細(xì)胞量),經(jīng)過(guò)一周之后每3天測(cè)量腫瘤直徑,3周后頸椎脫臼處死小鼠,剝離瘤塊測(cè)量體積與重量。結(jié)果:1)293T-LMNA KO較293T-WT增殖能力下降(P0.05),細(xì)胞凋亡率上升(P0.05);293T-LMNA KO細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3沒(méi)明顯變化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表達(dá)上升(P0.05),P16表達(dá)上升(P0.05);HepG2-LMNA KO較HepG2-WT增殖能力顯著下降(P0.01),細(xì)胞凋亡率上升(P0.05);HepG2-LMNA KO細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3表達(dá)量沒(méi)顯著變化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表達(dá)上升(P0.05),P16表達(dá)上升(P0.05)。2)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示293T-LMNA KO較293T-WT細(xì)胞水平遷移能力顯著下降(P0.001),HepG2-LMNA KO較HepG2-WT細(xì)胞水平遷移能力顯著下降(P0.001)。transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示293T-LMNA KO細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(P0.05),HepG2-LMNA KO侵襲能力增強(qiáng),兩種敲除細(xì)胞MMP2表達(dá)量升高,integrinβ4表達(dá)量升高(P0.01)。3)軟瓊脂培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示293T-LMNA KO較293T-WT克隆數(shù)量下降(P0.05),克隆體直徑減少(P0.05),平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示293T-LMNA KO克隆數(shù)量減少(P0.05),裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示293T-LMNA KO瘤塊體積與質(zhì)量均下降(P0.05);軟瓊脂培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HepG2-LMNA KO較HepG2-WT克隆數(shù)量下降(P0.05),克隆體直徑減少(P0.05),平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HepG2-LMNA KO克隆數(shù)量減少(P0.05),裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HepG2-LMNA KO瘤塊體積減少(P0.05)質(zhì)量下降(P0.01)。結(jié)論:兩株LMNA KO細(xì)胞增殖能力下降,遷移能力下降,軟瓊脂克隆形成能力下降,且裸鼠體內(nèi)成瘤能力也顯著下降,但細(xì)胞侵襲能力升高;兩株LMNA KO存在G2/M期阻滯,P16的表達(dá)上升,且CDK1的表達(dá)下降。
【圖文】：

經(jīng)過(guò)含有氨芐霉PCR 對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行初步挑選（圖gRNA 與 PX459 成功連接（圖1-1 PX458-LMNAgRNA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建1 PX458-LMNAgRNArecombinant plasmid320bp。 B：重組質(zhì)粒的 DNA 測(cè)序顯示所設(shè)計(jì)合成的PX-459-gRNA3和PX-459PX-459-gRNA1 和 PX-459-gRNA296 孔板開始單克隆挑選。挑純之后提取單克隆兩側(cè) 400bp 左右序列，測(cè)序結(jié)果顯示在的 LMNA 兩個(gè)等位基因（1-2A）。然后我們利用LMNA等位都缺失若干堿基（圖293T 單克隆細(xì)胞株在2019屆碩士學(xué)位論文1-1A）。1-1B）。LMNAgRNArecombinant4 條459-gRNA4重組gRNA2 重組質(zhì)粒。利gRNA 附1-2B）。

HepG2和293T細(xì)胞內(nèi)敲除LMNA基因?qū)?xì)胞形態(tài)和生物學(xué)功能的影響LMNA 敲除細(xì)胞。5 RNA-seq 差異表達(dá)基因的根據(jù) RNA-seq 結(jié)果，我們對(duì)部分差異表達(dá)基因進(jìn)行了現(xiàn)與 RNA-seq 結(jié)果一致，，降，MMP2 表達(dá)升高，但蛋白免疫印跡結(jié)果顯示1-5A,B）。WB 驗(yàn)證western blotLMNAKO 型細(xì)胞較于野生型細(xì)胞P15 卻沒(méi)有明顯變化（圖2019屆碩士學(xué)位論文驗(yàn)證，發(fā)CDK1 表達(dá)下
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2656901