【摘要】：第一章利用CRISPR/Cas9技術在HepG2和293T細胞內敲除LMNA基因目的:利用CRISPR/Cas9技術對體外培養(yǎng)的293T與HepG2細胞株的LMNA(Lamin A,A型核纖層蛋白)基因進行編輯,獲得LMNA基因敲除細胞系,并觀察細胞核膜變化以及整體細胞形態(tài)的變化。方法:利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對293T細胞以及HepG2細胞的LMNA基因進行編輯,然后進行嘌呤霉素篩選,單克隆挑取,DNA測序和western blot鑒定,對獲取的LMNA雙等位基因敲除細胞克隆進行擴增與保存。利用掃描電鏡和透射電鏡對LMNA敲除(LMNA KO)以及野生型(WT)細胞的形態(tài)與核膜形態(tài)進行觀察,同時利用免疫熒光技術對LMNA敲除細胞核膜與細胞骨架進行觀察。結果:DNA測序結果顯示293T與HepG2單克隆細胞均有堿基缺失,蛋白免疫印跡結果顯示Lamin A/C不表達,成功獲得兩株LMNA基因敲除細胞。光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)后,293T細胞的LMNA基因敲除后,與野生型比較其胞體變小變圓,突出連接減少并變細;HepG2細胞的LMNA基因敲除后,與野生型比較其細胞變成多邊形,胞質較為均勻的分布在核周。透射電鏡發(fā)現(xiàn)LMNA基因敲除后,細胞核膜失去光滑,變得凹凸不平。結論:Lamin A/C的缺失會導致體外培養(yǎng)細胞的核膜變形,進一步導致整個細胞形態(tài)的改變。第二章敲除LMNA基因對HepG2和293T細胞增殖、遷移、克隆形成能力與體內致瘤性的影響目的:比較293T與HepG2細胞LMNA基因敲除細胞株(LMNA KO)和野生型細胞系(WT)的細胞增殖、遷移、克隆形成能力以及體外與體內的致瘤性,研究LMNA基因缺失對細胞生物學特性的影響,并探索相關分子機制。方法:1)將293T與HepG2細胞分為WT組和LMNA KO組,利用CCK-8法檢測細胞的增殖能力,利用流式細胞儀檢測細胞凋亡與細胞周期。LMNA KO細胞內過表達LMNA,Western blot檢測細胞周期相關蛋白CDK1與Cyclin B1,DNA損傷標志物γ-H2A.X,抑癌基因RB和P16的表達量以及組蛋白表觀遺傳修飾情況(H3K9me3、H3K27me3)。2)通過細胞劃痕和transwell實驗對WT與LMNA KO細胞的遷移與穿孔能力進行檢測,并通過western blot檢測MMP2,MMP9,COL1A1與integrinβ4的表達量。3)軟瓊脂克隆形成實驗:6孔板每孔每種加入3000個細胞,4周后測量克隆體直徑與數(shù)量;平板克隆形成實驗:六孔板每孔加入1000細胞,2周后計數(shù)克隆體數(shù)量。4)裸鼠體內致瘤性實驗:將24只4周齡雌性裸鼠隨機分為4組(n=6),分別注射293T,HepG2,293T-LMNA KO與HepG2-LMNA KO四種細胞(每只裸鼠前肢兩側腋下各注射2x10~6細胞量),經過一周之后每3天測量腫瘤直徑,3周后頸椎脫臼處死小鼠,剝離瘤塊測量體積與重量。結果:1)293T-LMNA KO較293T-WT增殖能力下降(P0.05),細胞凋亡率上升(P0.05);293T-LMNA KO細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3沒明顯變化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表達上升(P0.05),P16表達上升(P0.05);HepG2-LMNA KO較HepG2-WT增殖能力顯著下降(P0.01),細胞凋亡率上升(P0.05);HepG2-LMNA KO細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3表達量沒顯著變化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表達上升(P0.05),P16表達上升(P0.05)。2)劃痕實驗結果顯示293T-LMNA KO較293T-WT細胞水平遷移能力顯著下降(P0.001),HepG2-LMNA KO較HepG2-WT細胞水平遷移能力顯著下降(P0.001)。transwell實驗結果顯示293T-LMNA KO細胞侵襲能力增強(P0.05),HepG2-LMNA KO侵襲能力增強,兩種敲除細胞MMP2表達量升高,integrinβ4表達量升高(P0.01)。3)軟瓊脂培養(yǎng)實驗結果顯示293T-LMNA KO較293T-WT克隆數(shù)量下降(P0.05),克隆體直徑減少(P0.05),平板克隆實驗結果顯示293T-LMNA KO克隆數(shù)量減少(P0.05),裸鼠體內成瘤實驗結果顯示293T-LMNA KO瘤塊體積與質量均下降(P0.05);軟瓊脂培養(yǎng)實驗結果顯示HepG2-LMNA KO較HepG2-WT克隆數(shù)量下降(P0.05),克隆體直徑減少(P0.05),平板克隆實驗結果顯示HepG2-LMNA KO克隆數(shù)量減少(P0.05),裸鼠體內成瘤實驗結果顯示HepG2-LMNA KO瘤塊體積減少(P0.05)質量下降(P0.01)。結論:兩株LMNA KO細胞增殖能力下降,遷移能力下降,軟瓊脂克隆形成能力下降,且裸鼠體內成瘤能力也顯著下降,但細胞侵襲能力升高;兩株LMNA KO存在G2/M期阻滯,P16的表達上升,且CDK1的表達下降。
【圖文】：

經過含有氨芐霉PCR 對重組質粒進行初步挑選（圖gRNA 與 PX459 成功連接（圖1-1 PX458-LMNAgRNA 重組質粒的構建1 PX458-LMNAgRNArecombinant plasmid320bp。 B：重組質粒的 DNA 測序顯示所設計合成的PX-459-gRNA3和PX-459PX-459-gRNA1 和 PX-459-gRNA296 孔板開始單克隆挑選。挑純之后提取單克隆兩側 400bp 左右序列，測序結果顯示在的 LMNA 兩個等位基因（1-2A）。然后我們利用LMNA等位都缺失若干堿基（圖293T 單克隆細胞株在2019屆碩士學位論文1-1A）。1-1B）。LMNAgRNArecombinant4 條459-gRNA4重組gRNA2 重組質粒。利gRNA 附1-2B）。

HepG2和293T細胞內敲除LMNA基因對細胞形態(tài)和生物學功能的影響LMNA 敲除細胞。5 RNA-seq 差異表達基因的根據(jù) RNA-seq 結果，我們對部分差異表達基因進行了現(xiàn)與 RNA-seq 結果一致，，降，MMP2 表達升高，但蛋白免疫印跡結果顯示1-5A,B）。WB 驗證western blotLMNAKO 型細胞較于野生型細胞P15 卻沒有明顯變化（圖2019屆碩士學位論文驗證，發(fā)CDK1 表達下
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2656901