【摘要】：為了更好地適應多變的外界環(huán)境,植物體內進化出了一套抵御外界脅迫的分子機制,包括信號的感知、傳導及下游的轉錄調控、應答反應等。其中鈣信號轉導途徑和促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)途徑對植物應答外界脅迫起到了至關重要的作用。本試驗對小麥鈣調素基因TaCaM1和促分裂原活化蛋白激酶基因TaMAPK3的分子特征和抗逆特性進行了研究。主要研究結果如下:1、利用生物信息學方法,分析預測了小麥鈣調素基因TaCaM1的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列,并對其進行了系統(tǒng)進化分析、同源氨基酸序列比對、跨膜螺旋域分析、三級結構預測和亞細胞定位預測。結果表明:TaCaM1的核苷酸序列全長為759bp,編碼149個氨基酸,不含有跨膜螺旋域,預測的亞細胞定位主要在細胞質,少量位于細胞核。2、利用RT-PCR技術對TaCaM1在不同逆境下的表達特征進行分析,得知TaCaM1在低磷脅迫下表達量減少,在低氮、鹽分和干旱脅迫下表達量均略有增加。3、利用DNA重組技術構建了融合TaCaM1的正、反義雙元表達載體及融合TaCaM1和TaMAPK3的亞細胞定位表達載體;利用農桿菌介導法對TaCaM1進行煙草和小麥的遺傳轉化,獲得了正、反義轉基因煙草植株及超表達該基因的小麥植株。利用注射煙草結合熒光檢測的方法對TaCaM1和TaMAPK3表達的蛋白進行亞細胞定位檢測,表明TaCaM1定位于細胞質與細胞核,TaMAPK3定位于細胞核。4、利用土培法和水培法對TaCaM1正、反義轉基因煙草株系進行了抗逆功能鑒定,發(fā)現(xiàn)在低磷脅迫下,與野生型煙草相比,正義系煙草植株生長單薄柔弱,根系短,葉面積小,葉綠素含量低,鮮干重小,反義系煙草植株茂盛健壯,根系長,葉面積大,葉綠素含量高,鮮干重大;而在低氮、鹽分和干旱脅迫下,正義系煙草植株較野生型長勢茂盛,根系長,葉面積大,葉綠素含量高,鮮干重大;反義系弱小,根系短,葉面積小,葉綠素含量低,鮮干重小。說明TaCaM1基因對低磷、低氮、鹽分及干旱逆境具有一定的調控作用。5、結合課題組前期工作,對TaMAPK3轉基因系煙草在干旱、鹽分及ABA脅迫下的氣孔特征進行觀察分析,結果表明,在鹽分脅迫下,TaMAPK3轉基因系煙草較野生型氣孔關閉較快,說明高鹽逆境下TaMAPK3可能通過調控下游基因功能,快速積累ABA,進而促進氣孔關閉,減少蒸騰,抵御滲透脅迫。6、利用高通量測序技術,對低磷逆境處理48h的TaMAPK3轉基因系煙草和野生型煙草轉錄組進行了分析,探究了兩者差異基因的GO功能富集及KEGG代謝通路的富集情況。結果表明其差異基因的GO功能主要富集在對傷害的響應及多種代謝酶活性調節(jié);KEGG代謝通路主要富集在異喹啉生物堿生物合成、二苯乙烯、二芳基庚酸和姜醇的生物合成、氨基酸的生物合成、酪氨酸代謝和丙酮酸代謝等方面。表明TaMAPK3可能通過激活相關抗逆基因,調控相應代謝過程,響應低磷逆境。7、利用酵母雙雜交技術和雙分子熒光互補技術進行TaMAPK3互作蛋白的篩選,表明TaMAPK3與TaWRKY46有互作關系。說明TaMAPK3可能通過調控下游WRKY型轉錄因子基因進而發(fā)揮抗逆功能。
【圖文】：

提出鈣調素的中央螺旋很容易發(fā)生扭曲，使兩邊的球狀結構域靠近，這就說明了中央螺旋含有一段具有柔性的非螺旋區(qū)，當鈣調素與其靶酶結合時，這段非螺旋區(qū)可以將中央螺旋伸展開來，方便鈣調素與不同大小的靶酶相結合（圖1B）[22-23]。鈣調素自身沒有酶活性，它的主要作用是通過與靶蛋白結合來傳遞鈣信號。植物受到外界環(huán)境脅迫的刺激時，植物細胞內的鈣離子濃度會發(fā)生瞬時變化，進而與鈣調素的 EF-hand 結構結合改變其構象，鈣調素構象的改變使其結合下游的鈣調素結合蛋白傳遞鈣信號，，促進生物反應的進行。并且有研究數據指出，植物在非生物脅迫如低溫、水分脅迫等條件下，體內鈣調素含量會相對升高。實驗還證明鈣調素同樣介導鹽脅迫誘導的信號傳導[24]。另外鈣調素還參與許多生物過程，包括酶活性的調節(jié)、細胞的分裂和分化、細胞骨架和細胞運動、細胞分泌、滲透調節(jié)、光合作用、花粉萌發(fā)、激素反應、核內酶系統(tǒng)和基因表達等[25]。鈣調素是普遍存在的，在一個特定的植物物種中，不同的 CaM 亞型在表達模式、靶蛋白結合能力以及生理功能上可能是不同的

當蛋白X 與蛋白 Y 間有相互作用時，可以使 BD 和 AD 在空間上接近，進而使下游報告基因表達（圖2）。在缺少報告基因表達的氨基酸的培養(yǎng)基上通過觀察報告基因是否表達來確定蛋白 X 與蛋白 Y間是否有互作。酵母雙雜系統(tǒng)可以用感興趣的蛋白來篩選互作蛋白，還可以用于檢測由 cDNA 文庫編碼的未知蛋白與目的蛋白間的互作關系。在后一種情況下，酵母雙雜交系統(tǒng)成為了研究在特定生物過程中蛋白質之間形成相互作用網絡的有力工具。
【學位授予單位】：河北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;S512.1

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本文編號：2656701