【摘要】：在棘尾蟲屬中以模式物種浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)研究得最為深入。浮萍棘尾蟲是研究細胞和分子生物學機制的重要生物,已經完成大核基因組測定,這使得棘尾蟲屬的基因功能研究成為可能�；蚯贸悄壳把芯炕蚬δ茏顬橛行У氖侄�。但在原生動物尤其是棘尾蟲屬的基因組上進行高效、精確的基因敲除來驗證基因功能的研究缺乏參考資料。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來發(fā)展最快速的基因組編輯技術,它能夠實現基因的定點編輯,因其更具高效性和靈活性而廣受研究者青睞。創(chuàng)建適合棘尾蟲的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠有效推動棘尾蟲基因功能的研究。本研究從探討棘尾蟲密碼子的偏好性入手,在棘尾蟲中創(chuàng)建CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),針對對棘尾蟲AdSS基因的功能開展實驗,以建立適合棘尾蟲基因功能研究的CRISPR技術平臺。主要結果如下:通過對棘尾蟲第3位密碼子的GC含量計算,發(fā)現第3位密碼子富含A和U。通過對浮萍棘尾蟲基因組進行PR2-plot繪圖分析,發(fā)現第3位堿基T的使用頻率高于A,C的使用頻率高于G。結合中性繪圖分析、ENC-plot繪圖分析、PCA分析,發(fā)現浮萍棘尾蟲基因組密碼子偏好性受突變和自然選擇的影響比較大,但與此同時也受到其他因素的影響,密碼子偏好性是多因素影響的結果。最終通過高表達優(yōu)越密碼子方法確定AGA、GGA、UUA等24個密碼子為最優(yōu)密碼子。通過PCR擴增方法在棘尾蟲中克隆到一個注釋為腺苷酸基琥拍酸合成酶的基因AdSS,通過核酸和蛋白序列比對,發(fā)現浮萍棘尾蟲AdSS基因與第四雙小核草履蟲、多子小瓜蟲和嗜熱四膜蟲高度同源。通過同時雙酶切cDNA和pEGFP-N1載體的方法構建定位AdSS基因的載體,驗證該基因主要位于細胞質的核糖體中。根據棘尾蟲密碼子偏好性分析得到的最優(yōu)密碼子改造載體中的Cas9蛋白,篩選出成功突變的質粒進行轉染,與此同時對浮萍棘尾蟲中的AdSS基因設計多個sgRNA打靶位點,成功獲得1個sgRNA作用于目的基因,并產生大片段缺失。AdSS基因被敲除后,蟲體的運動性明顯降低,生長發(fā)育也受到影響,少量蟲體產生畸形。為了檢測敲除效率,利用實時熒光定量PCR技術完成對突變體的檢測,證明該CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在棘尾蟲中實現目標基因的編輯。綜上所述,本研究篩選并驗證棘尾蟲的最優(yōu)密碼子,對敲除載體進行了優(yōu)化,成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現了對棘尾蟲AdSS基因的特異敲除,證明該系統(tǒng)可有效應用于棘尾蟲的基因組編輯,獲得的具有穩(wěn)定突變的細胞克隆和構建的CRISPR打靶載體為后續(xù)棘尾蟲基因功能的研究奠定了堅實的基礎。
【圖文】：

哈爾濱師范大學碩士學位論文因此，本研究以浮萍棘尾蟲為研究對象，，以最新的基因敲除技術 CRISPR/Cas作為研究目標，探索適合于棘尾蟲基因功能研究的 CRISPR 體系的構建，以期為自由生纖毛蟲基因功能的研究提供技術支持和參考思路，更為真核生物基因的遺傳進化分析奠定基礎，也為進一步研究纖毛蟲乃至高等動物細胞生命活動的分子生物學機制提供依據和參考。1.6 研究方案本研究首先在實驗室建立浮萍棘尾蟲原培養(yǎng)體系，然后用 G418 對浮萍棘尾蟲進行抗性篩選，與此同時根據密碼子偏好性研究得出的最優(yōu)密碼子來突變載體進而構建適合棘尾蟲的敲除載體，然后根據靶點設計gRNA并構建識別靶點載體最后驗證靶基因是否被敲除。具體技術路線如圖 1-1：

.5％的區(qū)間），則基因表達水平（表達）被鑒定為基因中 PC 評[50]。果碼子組成分析 CodonW 軟件對浮萍棘尾蟲全基因組編碼序列進行分析。浮萍 含量范圍為 22.1％ 58.6％，GC 含量主要分布在 25% 40%，表明基因組中有 AT 富集（見圖 2-1）。ENC 的取值范圍為 20～映的密碼子偏性的強弱，當 ENC 為 20 時，表示同義密碼子，表示同義密碼子沒有偏倚；按照慣例以 35 作為偏性強弱的區(qū)蟲基因組 ENC 取值范圍在 24.8~61 之間，并且大部分大于 4密碼子偏性較弱。密碼子第 3 位 GC 的平均含量為 33.7%，G8.68%和 30.1%，說明密碼子堿基組成多為 A 和 U。
【學位授予單位】：哈爾濱師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2654268