【摘要】：在棘尾蟲屬中以模式物種浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)研究得最為深入。浮萍棘尾蟲是研究細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制的重要生物,已經(jīng)完成大核基因組測(cè)定,這使得棘尾蟲屬的基因功能研究成為可能�；蚯贸悄壳把芯炕蚬δ茏顬橛行У氖侄�。但在原生動(dòng)物尤其是棘尾蟲屬的基因組上進(jìn)行高效、精確的基因敲除來驗(yàn)證基因功能的研究缺乏參考資料。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來發(fā)展最快速的基因組編輯技術(shù),它能夠?qū)崿F(xiàn)基因的定點(diǎn)編輯,因其更具高效性和靈活性而廣受研究者青睞。創(chuàng)建適合棘尾蟲的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠有效推動(dòng)棘尾蟲基因功能的研究。本研究從探討棘尾蟲密碼子的偏好性入手,在棘尾蟲中創(chuàng)建CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),針對(duì)對(duì)棘尾蟲AdSS基因的功能開展實(shí)驗(yàn),以建立適合棘尾蟲基因功能研究的CRISPR技術(shù)平臺(tái)。主要結(jié)果如下:通過對(duì)棘尾蟲第3位密碼子的GC含量計(jì)算,發(fā)現(xiàn)第3位密碼子富含A和U。通過對(duì)浮萍棘尾蟲基因組進(jìn)行PR2-plot繪圖分析,發(fā)現(xiàn)第3位堿基T的使用頻率高于A,C的使用頻率高于G。結(jié)合中性繪圖分析、ENC-plot繪圖分析、PCA分析,發(fā)現(xiàn)浮萍棘尾蟲基因組密碼子偏好性受突變和自然選擇的影響比較大,但與此同時(shí)也受到其他因素的影響,密碼子偏好性是多因素影響的結(jié)果。最終通過高表達(dá)優(yōu)越密碼子方法確定AGA、GGA、UUA等24個(gè)密碼子為最優(yōu)密碼子。通過PCR擴(kuò)增方法在棘尾蟲中克隆到一個(gè)注釋為腺苷酸基琥拍酸合成酶的基因AdSS,通過核酸和蛋白序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)浮萍棘尾蟲AdSS基因與第四雙小核草履蟲、多子小瓜蟲和嗜熱四膜蟲高度同源。通過同時(shí)雙酶切cDNA和pEGFP-N1載體的方法構(gòu)建定位AdSS基因的載體,驗(yàn)證該基因主要位于細(xì)胞質(zhì)的核糖體中。根據(jù)棘尾蟲密碼子偏好性分析得到的最優(yōu)密碼子改造載體中的Cas9蛋白,篩選出成功突變的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,與此同時(shí)對(duì)浮萍棘尾蟲中的AdSS基因設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA打靶位點(diǎn),成功獲得1個(gè)sgRNA作用于目的基因,并產(chǎn)生大片段缺失。AdSS基因被敲除后,蟲體的運(yùn)動(dòng)性明顯降低,生長(zhǎng)發(fā)育也受到影響,少量蟲體產(chǎn)生畸形。為了檢測(cè)敲除效率,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)完成對(duì)突變體的檢測(cè),證明該CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在棘尾蟲中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的編輯。綜上所述,本研究篩選并驗(yàn)證棘尾蟲的最優(yōu)密碼子,對(duì)敲除載體進(jìn)行了優(yōu)化,成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)棘尾蟲AdSS基因的特異敲除,證明該系統(tǒng)可有效應(yīng)用于棘尾蟲的基因組編輯,獲得的具有穩(wěn)定突變的細(xì)胞克隆和構(gòu)建的CRISPR打靶載體為后續(xù)棘尾蟲基因功能的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

哈爾濱師范大學(xué)碩士學(xué)位論文因此，本研究以浮萍棘尾蟲為研究對(duì)象，，以最新的基因敲除技術(shù) CRISPR/Cas作為研究目標(biāo)，探索適合于棘尾蟲基因功能研究的 CRISPR 體系的構(gòu)建，以期為自由生纖毛蟲基因功能的研究提供技術(shù)支持和參考思路，更為真核生物基因的遺傳進(jìn)化分析奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究纖毛蟲乃至高等動(dòng)物細(xì)胞生命活動(dòng)的分子生物學(xué)機(jī)制提供依據(jù)和參考。1.6 研究方案本研究首先在實(shí)驗(yàn)室建立浮萍棘尾蟲原培養(yǎng)體系，然后用 G418 對(duì)浮萍棘尾蟲進(jìn)行抗性篩選，與此同時(shí)根據(jù)密碼子偏好性研究得出的最優(yōu)密碼子來突變載體進(jìn)而構(gòu)建適合棘尾蟲的敲除載體，然后根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)gRNA并構(gòu)建識(shí)別靶點(diǎn)載體最后驗(yàn)證靶基因是否被敲除。具體技術(shù)路線如圖 1-1：

.5％的區(qū)間），則基因表達(dá)水平（表達(dá)）被鑒定為基因中 PC 評(píng)[50]。果碼子組成分析 CodonW 軟件對(duì)浮萍棘尾蟲全基因組編碼序列進(jìn)行分析。浮萍 含量范圍為 22.1％ 58.6％，GC 含量主要分布在 25% 40%，表明基因組中有 AT 富集（見圖 2-1）。ENC 的取值范圍為 20～映的密碼子偏性的強(qiáng)弱，當(dāng) ENC 為 20 時(shí)，表示同義密碼子，表示同義密碼子沒有偏倚；按照慣例以 35 作為偏性強(qiáng)弱的區(qū)蟲基因組 ENC 取值范圍在 24.8~61 之間，并且大部分大于 4密碼子偏性較弱。密碼子第 3 位 GC 的平均含量為 33.7%，G8.68%和 30.1%，說明密碼子堿基組成多為 A 和 U。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2654268