【摘要】：多粘菌素作為抗多重耐藥革蘭氏陰性菌的最后一道防線,現(xiàn)在已經被廣泛應用于革蘭氏陰性菌的治療。近年來,越來越多的研究表明,陽離子抗菌肽多粘菌素同樣可以作用于革蘭氏陽性菌。而隨著多粘菌素的應用,革蘭氏陽性菌中已經發(fā)現(xiàn)了應對這種陽離子抗菌肽的抗性機制。dlt操縱子可通過對革蘭氏陽性菌細胞壁的丙酰化,對細胞表面的正電荷進行修飾,從而增加對多粘菌素E的抗性。本文著眼于多粘菌素E和枯草芽孢桿菌的相互作用,對dlt操縱子在多粘菌素E的抗性機制中的作用展開研究。本文選取枯草芽孢桿菌WB800來源的dlt操縱子基因和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pWBUC01,設計XhoⅠ和MluⅠ為雙酶切位點,經酶切連接在大腸桿菌BW25113中構建dlt操縱子重組質粒pWOP。隨后,通過Spizizen化學轉化法,將重組質粒pWOP轉入枯草芽孢桿菌SCK6中,成功獲得dlt操縱子過表達的枯草芽孢桿菌SCK6-2。通過比較多粘菌素E對枯草芽孢桿菌SCK6/pWBUC01(枯草芽孢桿菌SCK6-1)和枯草芽孢桿菌SCK6-2的MIC值,發(fā)現(xiàn)SCK6-2比SCK6-1菌株更耐受多粘菌素E,說明dlt操縱子過表達有助于提高枯草芽孢桿菌對多粘菌素E的耐受性。通過比較SCK6-1和SCK6-2菌株在多粘菌素E處理下的生長曲線及CFU,發(fā)現(xiàn)dlt操縱子過表達能提高多粘菌素E處理下枯草芽孢桿菌的存活率。為了進一步研究dlt操縱子過表達提高枯草芽孢桿菌對多粘菌素E耐受性的原因,我們比較了多粘菌素E處理下菌株培養(yǎng)上清液的OD_(260nm)和OD_(280nm)下吸光度及NPN熒光值變化,發(fā)現(xiàn)dlt操縱子可減弱多粘菌素E對枯草芽孢桿菌通透性的影響。隨后,使用陽離子蛋白質細胞色素c表征dlt操縱子過表達后細胞表面凈負電荷的變化,發(fā)現(xiàn)dlt操縱子的過表達會降低枯草芽孢桿菌與細胞色素c的結合,表明dlt操縱子的過表達可增加枯草芽孢桿菌表面的正電荷,降低凈負電荷量,從而減弱帶正電荷的多粘菌素E對細胞的靜電結合作用。由于多粘菌素E生產菌多粘類芽孢桿菌不含dlt操縱子,dlt操縱子在多粘類芽孢桿菌中表達有望提高其抗性,從而提高多粘菌素E的產量。為此,本實驗考察了枯草芽孢桿菌源dlt操縱子在多粘類芽孢桿菌中的表達及其影響。首先優(yōu)化了多粘類芽孢桿菌ATCC842和多粘類芽孢桿菌C12的電轉化條件,建立了最優(yōu)的電轉化體系。接著,構建了含dltA基因的重組質粒pWDA。然后,在電轉化最優(yōu)體系下,將pWDA和pWOP分別電轉化多粘類芽孢桿菌ATCC842,發(fā)現(xiàn)pWDA能被成功轉化,但效率比較低;而pWOP不能被成功轉化至菌株ATCC842。可能的原因是多粘類芽孢桿菌電轉化效率本身比較低。另外,dlt操縱子比dltA大的多,這進一步增加了pWOP電轉化難度。后續(xù)實驗中,需要進一步提高電轉化效率,另外也可以建立更有效的多粘類芽孢桿菌轉化方法。由此,進一步研究dlt操縱子表達為提高多粘類芽孢桿菌對多粘菌素E抗性的可能性及其機制,為今后增加多粘菌素E的發(fā)酵產量提供新的思路。
【圖文】：

圖 1-1 多粘菌素 B 和粘菌素的化學結構[6]Figure 1-1. Chemical structure of polymyxin B and colistin[6]注：多粘菌素的不同顏色區(qū)域如下：黃色，脂肪�；�; 綠色，線性三肽片段; 紅色，七肽的極性殘基; 藍色，七肽環(huán)內的疏水基序。多粘菌素B和多粘菌素E 的6 號位置分別是D-Phe和 D-Leu。脂肪酸：6-甲基辛酸或異辛酸或辛酸或庚酸; Thr：蘇氨酸; Phe：苯丙氨酸; Leu：亮氨酸; Dab：α，γ-二氨基丁酸。臨床上多粘菌素主要應用于革蘭氏陰性菌，被廣泛接受的作用機制主要是對細胞膜的破壞和對呼吸鏈的脅迫作用，前者是一種主要機制，而后者常被稱為是一種“輔助機制”[10]。在引起細胞膜破壞的機制中，多粘菌素通過靜電相互作用結合至革蘭氏陰性細菌表面，后通過“自我攝取”機制對細胞膜進行穿孔，對細胞膜的完整性進行破壞從而殺死細菌[2, 3, 8, 11]。在此機制中，多粘菌素中一個重要的結構特征是存在多個帶正電荷的 L-α-γ-二氨基丁酸（Dab）側鏈與細菌表面帶負電荷的脂質 A 上的磷酸基團相互作用。此外，已有研究證明缺乏脂肪�；驳� N末端 Thr2-Dab3二肽基序的多粘菌素 B 九肽（PMBN）無法行使抗菌機制。因此，，

圖 1-2 氧化應激誘導多粘菌素產生羥自由基的死亡機制[30, 35]Figure1-2. Death mechanism of polymyxin induced by oxidative stress to phydroxyl radicals[30, 35].菌素通過細胞膜后，刺激三羧酸循環(huán)以加速 NADH 的產生，并且通過電2-的產生。O2-攻擊鐵-硫簇以釋放 Fe2+。O2-通過 SOD 轉化為 H2O2。在芬2-和 Fe2+轉化為 OH 和 Fe3+。細胞內 OH、O2-和 H2O2對 DNA，脂質和蛋白損害最終導致細胞死亡。細胞呼吸的副產物，超氧化物，過氧化氫和羥基自由基可統(tǒng)稱為 R細胞毒性。但因細胞內不存在可以解毒羥基自由基的酶，所以羥基的氧化毒害作用比超氧化物和過氧化氫的作用尖銳[27]。這種過胞的氧化殺傷機制可以增加我們對多粘菌素作用于革蘭氏陽性菌一步認識。菌素對 Exportal 的破壞Alberto Vega 等人研究發(fā)現(xiàn)，在亞致死濃度下，多粘菌素 B 可以優(yōu)
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q93

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本文編號：2646907