【摘要】：多粘菌素作為抗多重耐藥革蘭氏陰性菌的最后一道防線,現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于革蘭氏陰性菌的治療。近年來,越來越多的研究表明,陽離子抗菌肽多粘菌素同樣可以作用于革蘭氏陽性菌。而隨著多粘菌素的應(yīng)用,革蘭氏陽性菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了應(yīng)對這種陽離子抗菌肽的抗性機(jī)制。dlt操縱子可通過對革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的丙酰化,對細(xì)胞表面的正電荷進(jìn)行修飾,從而增加對多粘菌素E的抗性。本文著眼于多粘菌素E和枯草芽孢桿菌的相互作用,對dlt操縱子在多粘菌素E的抗性機(jī)制中的作用展開研究。本文選取枯草芽孢桿菌WB800來源的dlt操縱子基因和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pWBUC01,設(shè)計(jì)XhoⅠ和MluⅠ為雙酶切位點(diǎn),經(jīng)酶切連接在大腸桿菌BW25113中構(gòu)建dlt操縱子重組質(zhì)粒pWOP。隨后,通過Spizizen化學(xué)轉(zhuǎn)化法,將重組質(zhì)粒pWOP轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌SCK6中,成功獲得dlt操縱子過表達(dá)的枯草芽孢桿菌SCK6-2。通過比較多粘菌素E對枯草芽孢桿菌SCK6/pWBUC01(枯草芽孢桿菌SCK6-1)和枯草芽孢桿菌SCK6-2的MIC值,發(fā)現(xiàn)SCK6-2比SCK6-1菌株更耐受多粘菌素E,說明dlt操縱子過表達(dá)有助于提高枯草芽孢桿菌對多粘菌素E的耐受性。通過比較SCK6-1和SCK6-2菌株在多粘菌素E處理下的生長曲線及CFU,發(fā)現(xiàn)dlt操縱子過表達(dá)能提高多粘菌素E處理下枯草芽孢桿菌的存活率。為了進(jìn)一步研究dlt操縱子過表達(dá)提高枯草芽孢桿菌對多粘菌素E耐受性的原因,我們比較了多粘菌素E處理下菌株培養(yǎng)上清液的OD_(260nm)和OD_(280nm)下吸光度及NPN熒光值變化,發(fā)現(xiàn)dlt操縱子可減弱多粘菌素E對枯草芽孢桿菌通透性的影響。隨后,使用陽離子蛋白質(zhì)細(xì)胞色素c表征dlt操縱子過表達(dá)后細(xì)胞表面凈負(fù)電荷的變化,發(fā)現(xiàn)dlt操縱子的過表達(dá)會降低枯草芽孢桿菌與細(xì)胞色素c的結(jié)合,表明dlt操縱子的過表達(dá)可增加枯草芽孢桿菌表面的正電荷,降低凈負(fù)電荷量,從而減弱帶正電荷的多粘菌素E對細(xì)胞的靜電結(jié)合作用。由于多粘菌素E生產(chǎn)菌多粘類芽孢桿菌不含dlt操縱子,dlt操縱子在多粘類芽孢桿菌中表達(dá)有望提高其抗性,從而提高多粘菌素E的產(chǎn)量。為此,本實(shí)驗(yàn)考察了枯草芽孢桿菌源dlt操縱子在多粘類芽孢桿菌中的表達(dá)及其影響。首先優(yōu)化了多粘類芽孢桿菌ATCC842和多粘類芽孢桿菌C12的電轉(zhuǎn)化條件,建立了最優(yōu)的電轉(zhuǎn)化體系。接著,構(gòu)建了含dltA基因的重組質(zhì)粒pWDA。然后,在電轉(zhuǎn)化最優(yōu)體系下,將pWDA和pWOP分別電轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌ATCC842,發(fā)現(xiàn)pWDA能被成功轉(zhuǎn)化,但效率比較低;而pWOP不能被成功轉(zhuǎn)化至菌株ATCC842�？赡艿脑蚴嵌嗾愁愌挎邨U菌電轉(zhuǎn)化效率本身比較低。另外,dlt操縱子比dltA大的多,這進(jìn)一步增加了pWOP電轉(zhuǎn)化難度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,需要進(jìn)一步提高電轉(zhuǎn)化效率,另外也可以建立更有效的多粘類芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法。由此,進(jìn)一步研究dlt操縱子表達(dá)為提高多粘類芽孢桿菌對多粘菌素E抗性的可能性及其機(jī)制,為今后增加多粘菌素E的發(fā)酵產(chǎn)量提供新的思路。
【圖文】：

圖 1-1 多粘菌素 B 和粘菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)[6]Figure 1-1. Chemical structure of polymyxin B and colistin[6]注：多粘菌素的不同顏色區(qū)域如下：黃色，脂肪酰基鏈; 綠色，線性三肽片段; 紅色，七肽的極性殘基; 藍(lán)色，七肽環(huán)內(nèi)的疏水基序。多粘菌素B和多粘菌素E 的6 號位置分別是D-Phe和 D-Leu。脂肪酸：6-甲基辛酸或異辛酸或辛酸或庚酸; Thr：蘇氨酸; Phe：苯丙氨酸; Leu：亮氨酸; Dab：α，γ-二氨基丁酸。臨床上多粘菌素主要應(yīng)用于革蘭氏陰性菌，被廣泛接受的作用機(jī)制主要是對細(xì)胞膜的破壞和對呼吸鏈的脅迫作用，前者是一種主要機(jī)制，而后者常被稱為是一種“輔助機(jī)制”[10]。在引起細(xì)胞膜破壞的機(jī)制中，多粘菌素通過靜電相互作用結(jié)合至革蘭氏陰性細(xì)菌表面，后通過“自我攝取”機(jī)制對細(xì)胞膜進(jìn)行穿孔，對細(xì)胞膜的完整性進(jìn)行破壞從而殺死細(xì)菌[2, 3, 8, 11]。在此機(jī)制中，多粘菌素中一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)特征是存在多個(gè)帶正電荷的 L-α-γ-二氨基丁酸（Dab）側(cè)鏈與細(xì)菌表面帶負(fù)電荷的脂質(zhì) A 上的磷酸基團(tuán)相互作用。此外，已有研究證明缺乏脂肪�；驳� N末端 Thr2-Dab3二肽基序的多粘菌素 B 九肽（PMBN）無法行使抗菌機(jī)制。因此，，

圖 1-2 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)多粘菌素產(chǎn)生羥自由基的死亡機(jī)制[30, 35]Figure1-2. Death mechanism of polymyxin induced by oxidative stress to phydroxyl radicals[30, 35].菌素通過細(xì)胞膜后，刺激三羧酸循環(huán)以加速 NADH 的產(chǎn)生，并且通過電2-的產(chǎn)生。O2-攻擊鐵-硫簇以釋放 Fe2+。O2-通過 SOD 轉(zhuǎn)化為 H2O2。在芬2-和 Fe2+轉(zhuǎn)化為 OH 和 Fe3+。細(xì)胞內(nèi) OH、O2-和 H2O2對 DNA，脂質(zhì)和蛋白損害最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物，超氧化物，過氧化氫和羥基自由基可統(tǒng)稱為 R細(xì)胞毒性。但因細(xì)胞內(nèi)不存在可以解毒羥基自由基的酶，所以羥基的氧化毒害作用比超氧化物和過氧化氫的作用尖銳[27]。這種過胞的氧化殺傷機(jī)制可以增加我們對多粘菌素作用于革蘭氏陽性菌一步認(rèn)識。菌素對 Exportal 的破壞Alberto Vega 等人研究發(fā)現(xiàn)，在亞致死濃度下，多粘菌素 B 可以優(yōu)
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q93

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本文編號：2646907