【摘要】：血紅素加氧酶(Hemeoxygenases,HO)是細(xì)胞中分解游離血紅素的限速酶,已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了兩種HO同工酶,分別為HO-1和HO-2。HO-1的表達(dá)由氧化應(yīng)激誘導(dǎo),在脾臟和肝臟中呈高水平表達(dá),而HO-2的表達(dá)則主要在腦和睪丸中。血紅素(Heme)是血紅蛋白的輔基,結(jié)構(gòu)上是含有一個(gè)亞鐵離子的卟啉環(huán)。在細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),一些血紅蛋白會(huì)釋放輔基Heme。游離Heme中的亞鐵離子能夠通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生自由基,誘導(dǎo)HO-1的表達(dá),保護(hù)細(xì)胞。HO-1對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用主要通過(guò)其分解Heme的產(chǎn)物保護(hù)細(xì)胞。HO-1能夠催化分解游離的Heme產(chǎn)生成膽綠素,一氧化碳(CO)和游離鐵。膽綠素在膽綠素還原酶的作用下形成膽紅素,膽紅素具有抗氧化作用,可以幫助細(xì)胞抵抗壞死并且膽紅素能夠抑制NF-κB介導(dǎo)的粘附分子的轉(zhuǎn)錄。這提示我們HO-1可能具有抵抗炎癥的作用,在此過(guò)程中,HO-1分解Heme產(chǎn)生的游離鐵誘導(dǎo)的鐵蛋白可能也發(fā)揮著重要作用。在我們的研究中,衰老細(xì)胞中NF-κB激活,炎癥因子分泌增加,HO-1表達(dá)被抑制,可能進(jìn)一步激活NF-κB,促進(jìn)細(xì)胞衰老。此外,HO-1表達(dá)被抑制導(dǎo)致細(xì)胞中Fe的重要來(lái)源被阻斷,細(xì)胞增殖受阻。NRF2是HO-1的轉(zhuǎn)錄激活因子,NRF2是哺乳類(lèi)動(dòng)物最重要的抗氧化調(diào)控因子和解毒因子,它通過(guò)結(jié)合PRDX1,GSR,HO-1,FTH1等靶基因啟動(dòng)子序列的壓力應(yīng)答元件ARE,啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄,在細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮極其重要的作用。我們發(fā)現(xiàn),在衰老細(xì)胞中,NRF2的ARE結(jié)合活性被抑制,NRF2調(diào)控的下游靶基因的表達(dá)顯著降低,細(xì)胞抗氧化能力下降,細(xì)胞ROS和線(xiàn)粒體的Mito-Sox水平顯著升高。NF-κB是一種經(jīng)典的促炎因子,在細(xì)胞衰老過(guò)程中促進(jìn)衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)因子的表達(dá)。當(dāng)被促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子刺激時(shí),它又表現(xiàn)出抗凋亡作用。這可能也和它促衰老的作用密切相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn),ROS可以激活I(lǐng)κB激酶(IKK),釋放NF-κB入核并促進(jìn)IL-8和P53的激活,導(dǎo)致細(xì)胞衰老。有研究發(fā)現(xiàn),在早老癥患者細(xì)胞中,NF-κB能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄共激活因子CBP(CREB結(jié)合蛋白)-p300復(fù)合物抑制NRF2的活性。我們也同樣發(fā)現(xiàn),在衰老細(xì)胞中,NF-κB入核,p-p65蛋白水平增加,炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。因而抑制了 NRF2的ARE結(jié)合活性,破壞了細(xì)胞抗氧化的保護(hù)機(jī)制,導(dǎo)致ROS水平升高,從而進(jìn)一步激活NF-κB,為NF-κB的激活提供了持續(xù)的氧化應(yīng)激環(huán)境,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞衰老。為了探究HO-1保護(hù)細(xì)胞抵抗衰老的機(jī)制,以及NRF2和NF-κB對(duì)它的調(diào)控作用,我們開(kāi)展了以下研究工作。1.HO-1在衰老細(xì)胞中低表達(dá)我們分別用雙氧水、HU、射線(xiàn)誘導(dǎo)NHF細(xì)胞發(fā)生衰老,通過(guò)Western blot檢測(cè)幾種衰老模型中,HO-1的表達(dá)均明顯下調(diào)。同時(shí)我們還檢測(cè)了傳代衰老的NHF細(xì)胞中HO-1的表達(dá)也明顯下調(diào)。2.HO-1敲低導(dǎo)致細(xì)胞衰老及其機(jī)制為了探究HO-1表達(dá)下調(diào)和細(xì)胞衰老的因果關(guān)系,干擾HO-1后,通過(guò)EdU摻入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖能力明顯下降。通過(guò)SA-β-gal衰老染色發(fā)現(xiàn),衰老染色比例明顯上升。用Hemin處理NHF細(xì)胞6、12、24、48h,發(fā)現(xiàn)HO-1的蛋白水平明顯上調(diào)。用Hemin處理NHF細(xì)胞6h,檢測(cè)ROS發(fā)現(xiàn),ROS水平明顯升高。用NAC聯(lián)合Hemin處理NHF細(xì)胞,結(jié)果表明NAC能夠明顯抑制Hemin對(duì)HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)。說(shuō)明Heme升高ROS能夠誘導(dǎo)HO-1上調(diào)分解Heme。若HO-1缺乏會(huì)導(dǎo)致Heme在細(xì)胞內(nèi)積累。干擾HO-1后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS水平,發(fā)現(xiàn)ROS水平升高。用Hemin處理正常NHF細(xì)胞和干擾HO-1的NHF細(xì)胞6天,SA-β-gal衰老染色發(fā)現(xiàn),衰老染色比例上調(diào)。說(shuō)明細(xì)胞缺乏HO-1導(dǎo)致ROS升高,Heme積累產(chǎn)生細(xì)胞毒性,升高ROS,促進(jìn)細(xì)胞衰老。用DFO處理干擾HO-1的NHF細(xì)胞發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的衰老比例明顯增加。用FAS處理干擾HO-1的NHF細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的衰老比例明顯下調(diào)。說(shuō)明缺鐵是HO-1缺乏導(dǎo)致細(xì)胞衰老的重要機(jī)制。3.衰老細(xì)胞中NRF2活性被抑制是HO-1表達(dá)下調(diào)的原因用雙氧水處理雙氧水誘導(dǎo)衰老的NHF細(xì)胞檢測(cè)HO-1的蛋白水平,結(jié)果表明在衰老細(xì)胞中雙氧水對(duì)HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)能力明顯減弱。我們通過(guò)干擾NRF2來(lái)模擬NRF2受損的NHF細(xì)胞并用雙氧水和Hemin分別處理,結(jié)果表明干擾NRF2的細(xì)胞中過(guò)氧化氫和Hemin對(duì)HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)能力明顯減弱。接下來(lái)我們進(jìn)一步檢測(cè)了衰老細(xì)胞中其他NRF2靶基因的表達(dá)情況,分別用雙氧水和HU誘導(dǎo)NHF 6天構(gòu)建衰老模型,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)NRF2及NRF2靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示NQO1、GSTM4、GCLC、GCLM、GSR、TXNDR1、TALDO、TKT的mRNA水平明顯下降。通過(guò)檢測(cè)NRF2-ARE熒光素酶報(bào)告基因發(fā)現(xiàn),衰老細(xì)胞中NRF2-ARE結(jié)合活性顯著下降。說(shuō)明,在衰老細(xì)胞中NRF2-ARE結(jié)合活性受損,NRF2靶基因表達(dá)能力下降,細(xì)胞抗氧化能力下降,促進(jìn)細(xì)胞衰老。4.衰老細(xì)胞中NF-κB負(fù)調(diào)控HO-1的表達(dá)發(fā)揮促氧化作用通過(guò)Western blot檢測(cè)了傳代衰老的NHF細(xì)胞中p-p65的蛋白水平明顯上調(diào)。在傳代衰老的NHF細(xì)胞中干擾P65,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)HO-1的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在正常和衰老細(xì)胞中干擾P65,HO-1的表達(dá)均明顯上調(diào)。用雙氧水誘導(dǎo)NHF細(xì)胞衰老模型,干擾P65后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平,發(fā)現(xiàn)干擾P65后ROS水平被下調(diào)。說(shuō)明NF-κB在衰老細(xì)胞通過(guò)負(fù)調(diào)控HO-1的表達(dá)發(fā)揮促氧化作用,間接表明衰老細(xì)胞中NF-κB對(duì)NRF2有拮抗作用。5.在衰老細(xì)胞中NF-κB活性的維持需要持續(xù)的氧化應(yīng)激通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了雙氧水誘導(dǎo)的NHF衰老細(xì)胞和傳代衰老的NHF細(xì)胞的ROS水平,與對(duì)照相比,衰老細(xì)胞的ROS水平均明顯升高。用NAC處理雙氧水、HU、IR分別誘導(dǎo)的衰老NHF細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn),NAC處理后衰老細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)水平明顯下降。說(shuō)明衰老細(xì)胞中NF-κB活性的維持需要持續(xù)的氧化應(yīng)激。
【圖文】：

２．邐ＨＯ－１敲低導(dǎo)致細(xì)胞衰老逡逑為了探究Ｈ０－１表達(dá)下調(diào)和細(xì)胞衰老的因果關(guān)系，千擾Ｈ０－１后，通過(guò)ＥｄＵ逡逑摻入實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖能力明顯下降（圖２Ｂ）。干擾ＨＯ－１后正常培養(yǎng)逡逑ＮＨＦ細(xì)胞６天，通過(guò)ＳＡ－ｐ－ｇａｌ衰老染色發(fā)現(xiàn)，衰老染色比例比例明顯上升（圖逡逑２Ｃ）。說(shuō)明ＨＯ－１缺乏導(dǎo)致細(xì)胞衰老。逡逑Ａ逡逑ＳＣＲ邋ｓｉＨＣＭ逡逑Ｈｏ＾Ｉ逡逑Ｌ—＿邋邋邐—邐——逡逑ｏａｐｄｈ邐ｆＨＨＭＰ逡逑３０逡逑

能會(huì)導(dǎo)致底物Ｈｅｍｅ的迅速累積以及膽紅素的產(chǎn)生減少，進(jìn)而升高細(xì)胞的ＲＯＳ逡逑水平促進(jìn)細(xì)胞衰老。干擾ＨＯ－１后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ＲＯＳ水平，結(jié)果逡逑表明缺乏ＨＯ－１導(dǎo)致細(xì)胞ＲＯＳ水平上升，，抗氧化能力下降（圖４Ａ）。干擾ＨＯ－１逡逑后，用Ｈｅｍｉｎ處理細(xì)胞６天，通過(guò)ＳＡ－｜３－ｇａｌ衰老染色發(fā)現(xiàn)，衰老染色比例上調(diào)逡逑（圖４Ｂ）。以上結(jié)果表明，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的Ｈｅｍｅ會(huì)被ＨＯ－１迅速降逡逑解，產(chǎn)生的游離鐵被鐵結(jié)合蛋白結(jié)合不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。若細(xì)胞內(nèi)缺乏ＨＯ－１，逡逑則會(huì)導(dǎo)致游離的Ｈｅｍｅ大量積累，升高ＲＯＳ，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而促進(jìn)細(xì)胞衰老。逡逑３２逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q255

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