【摘要】：微管由交替出現(xiàn)的α微管蛋白和β微管蛋白組成,微管蛋白β-2b鏈(tubulin beta-2B chain,TUBB2B)是β微管蛋白的亞型基因,它是微管的主要成分。微管蛋白基因TUBB2B的突變會(huì)改變微管的正常功能和結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)TUBB2B蛋白第247位點(diǎn)天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸會(huì)導(dǎo)致小鼠大腦皮質(zhì)的損壞和異常發(fā)育,本文就TUBB2B突變基因TUBB2B(N247S)對(duì)微管聚合的影響展開分析。本實(shí)驗(yàn)以C57bl/6j小鼠總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,通過與T載體連接構(gòu)建了TUBB2B基因克隆載體,并通過點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了TUBB2B(N247S)基因克隆載體。使用DNA限制性酶切技術(shù)構(gòu)建了TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核表達(dá)載體,并在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下,將真核重組表達(dá)載體及空載體轉(zhuǎn)染至小鼠成纖維細(xì)胞L929中,設(shè)置空白組和對(duì)照組,對(duì)不同組的細(xì)胞進(jìn)行微管蛋白的提取,通過Western-blot技術(shù)對(duì)α微管蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析,收集表達(dá)的突變蛋白并通過磁分離技術(shù)進(jìn)行純化,為了研究突變蛋白對(duì)微管骨架的影響,對(duì)純化后的突變蛋白進(jìn)行體外聚合實(shí)驗(yàn)分析,所得結(jié)果如下:1.構(gòu)建的TUBB2B以及TUBB2B(N247S)克隆載體經(jīng)菌液PCR及DNA鑒定證明克隆載體構(gòu)建正確。2.目的片段與真核表達(dá)載體連接成功,并通過菌液PCR,雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果鑒定,成功構(gòu)建TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核重組表達(dá)載體。3.成功轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞,以及成功表達(dá)突變蛋白,經(jīng)過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,確定了以6孔板為準(zhǔn),最佳目的基因與轉(zhuǎn)染試劑的比例為8:1,且實(shí)現(xiàn)了TUBB2B基因在L929中的高效表達(dá)。4.轉(zhuǎn)染組與空白組及對(duì)照組進(jìn)行比較,游離態(tài)的α微管蛋白顯著高于對(duì)照組和空白組(P值分別為0.0001和0.0004),聚合態(tài)的α微管蛋白顯著低于對(duì)照組和空白組(P值分別為0.0004和0.0036)。5.磁分離技術(shù)純化可以得到較高濃度的目的蛋白。6.TUBB2B(N247S)突變蛋白對(duì)微管蛋白體外聚合具有一定的抑制作用。
【圖文】：

3 結(jié)果與分析 克隆載體的構(gòu)建 總 RNA 的提取j 小鼠進(jìn)行全腦的取樣，通過 mRNA 試劑盒提取 檢測(cè)，其濃度為 256 ng/μL，260/280 為 1.84，將提膠電泳上進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖 3.1 所示，可見在 2于反轉(zhuǎn)錄，見圖 1.1。將得到的 rna 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得進(jìn)行后續(xù) PCR 實(shí)驗(yàn)。

圖 1.2 TUBB2B 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1.2 PCR amplification of TUBB2B geM: DL1500; 1-6: TUBB2B PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖L1500; 1-6: PCR amplification of TUBB2隆載體的鑒定的 DNA 片段與 T 載體連接，，轉(zhuǎn)化至B 固體培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，白色的為多，說明連接效果較好。同時(shí)挑取白色擴(kuò)培后的菌液使用特異性引物和載體R，結(jié)果如圖 1.3，1.4，1.5 所示，分別，測(cè)序結(jié)果如圖所示，得到與目的片段體構(gòu)建成功。將陽(yáng)性菌液保菌，以備后
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2645434